褪黑素对油菜幼苗盐胁迫相关基因及mircoRNA表达的影响(3)
1.3. 褪黑素对盐胁迫相关基因的影响的检测
准备好第二批油菜幼苗，使用1 μM褪黑素处理12小时后，使用150 mM氯化钠处理油菜幼苗根部，并在处理后的0小时，3小时，6小时，12小时，24小时对油菜的地下部分进行取样，每种处理取样200毫克，样品使用液氮急速冷却后保存于-80摄氏度的超低温冰箱中。研究已经证实，在-80摄氏度环境可以保持组织样本中的RNA长时间内的完好不降解[16]。样本全部取好后，使用TransZol提取样本的总RNA。将样本使用液氮预冷的研钵中研磨成为粉末，每一份200毫克的样本加入1ml的TransZol试剂，使用涡旋仪充分混匀后放于室温下孵育5分钟。之后每管样本加入200 μl的三氯甲烷，剧烈振荡混匀30秒，室温下静置3分钟，后12000转离心机4摄氏度离心15分钟，取无色上层水相溶液600微升。加入600微升的异丙醇震荡混匀后放于-20摄氏度的冰箱中，静置沉淀1小时，后12000转离心机4摄氏度离心15分钟。倒去上清后加入1毫升的75%乙醇溶液，剧烈振荡混匀后12000转离心机4摄氏度离心15分钟。将乙醇水溶液尽量倒出，然后吹干沉淀，溶于100微升的DEPC处理水中。使用nanodrop测量提取的RNA的浓度。取总RNA 1000 ng，加入5*TS RT Buffer 4 μl，10 mM dNTPs 1 μl，Oligo(dT)引物1 μl，TransScript RT 反转录酶 1 μl，加水补足到20 μl，混匀后42摄氏度孵育30分钟，85摄氏度加热5秒钟停止反应，获得总cDNA。总cDNA加入40 μl的水稀释后用作模板。加入1 μl cDNA模板，各0.4 μl的两端引物，2* TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μl，用无菌水补足到20 μl，qPCR循环参数为95摄氏度30秒热启动，95摄氏度融链5秒，55摄氏度退火15秒，72摄氏度延伸45秒，45个循环，于qPCR仪中测定几个目标基因的水平。
1.4. 测定褪黑素对MircoRNA的影响
从Refseq网站（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/release/plant/）中下载所有植物RNA序列数，并从其中筛选得到来源于油菜的RNA序列132809条。使用RNAhybrid[17]对选取的microRNA与油菜全RNA进行测定，结果根据最大自由能（mfe）进行排序。据根据之前测定的几个基因的水平发现其中最大变化的时间点（12小时），作为之后取样的时间点。再次准备第三批油菜幼苗，使用1 μM褪黑素处理12小时后，在使用150 mM氯化钠处理12小时，每种处理取样200毫克，样品使用液氮急速冷却后保存于-80摄氏度的超低温冰箱中。提取RNA，使用NanoDrop测量RNA浓度后取10ug的RNA样本，加入5 μl的DNase I Buffer ,1 μl的DNase I，用DEPC处理水将容量补至50 μl，37摄氏度孵育30分钟后80摄氏度处理2分钟停止反应。将去除DNA的RNA样本取3.75 μl，加入mRQ Buffer 5 μl，mRQ酶1.25 μl，37摄氏度处理1小时，85摄氏度处理5分钟终止反应，加入30 μl的无菌水稀释后，用作qPCR模板，qPCR循环参数为95摄氏度30秒热启动，95摄氏度融链5秒，55摄氏度退火15秒，72摄氏度延伸10秒，42个循环。反向引物使用mRQ 3‘Primer通用引物，测定各mircoRNA在样本中的含量。