本研究通过筛选宁粳3号突变库,从中得到了一个粉质突变体W9142。通过图位克隆的方法,发现突变基因编码AGPase的一个大亚基,该基因的同源基因在拟南芥、玉米中也广泛存在[4]。本研究对W9142中基因OsAGPL2进行表达水平检测,探讨了W9142的突变机理,对该突变体的形态学特征和生理生化进行了初步的描述与分析。
1 材料和方法
1.1材料种植
  突变体W9142是来源于宁粳3号的突变体。将W9142与籼稻品种Dular杂交、自交,构建F2群体,之后利用F2:3群体进行基因的精细定位和图位克隆。所有群体均种植在江苏省南京市土桥实验站,田间管理同大田生产。种子成熟以后,及时分单株收种,备用。
1.2实验方法
1.2.1 成熟种子直链淀粉、总淀粉和总蛋白质含量的测定
取野生型和突变体W9142成熟籽粒,用JLGJ4.5糙米机(浙江台州粮仪厂)制备糙米,用JNMJ3精米机(浙江台州粮仪厂)制备精米,去除种皮、果皮、糊粉层和胚。用JFS-13A粉碎磨(浙江台州粮仪厂)磨碎后,过100目米筛,制备米粉。
直链淀粉含量测定按照农业部标准NY147-88进行;总淀粉含量使用 Megazyme总淀粉测定试剂盒测定;总蛋白含量使用FOSS公司Kjeltee 2300型全自动凯氏定氮仪测定。每个样品重复三次,取平均值[4]。
1.2.2 成熟种子胚乳横截面扫描电镜观察
将野生型和突变体W9142成熟种子从中间部分横切制成样品后,在3%的戊二醛溶液中室温浸泡 3h,然后用0.1 mol/L 的磷酸钠溶液(pH=6.8)冲洗3~5次,每次进行15min。接着用2%的四氧化锇溶液在4℃下固定过夜,固定后的样品用0.1mol/L的磷酸钠溶液(pH=6.8)冲洗2~3次,每次15min,然后用70%、80%、95%、100%乙醇溶液逐级脱水,每次5min,再在乙醇-异戊基醋酸(体积比为1∶3)混合液中浸泡1h,取出干燥,最后用金粉包被,在日立S-3000N 型扫描电子显微镜下观察(加速电压为10~20KV)[5]。
1.2.3  W9142的图位克隆
     在W9142与Dular的杂种F1植株上收取F2种子,挑选其中与W9142突变体一样表现为粉质不透明的F2种子,发芽后提取幼苗DNA 进行基因的精细定位。基因组DNA采用CTAB法提取[5]。PCR扩增反应体系如下:1μL DNA模板(约20ng),1μL 引物(0.2μmol/L),1μL dNTP (50μmol/L),1μL 10×缓冲液(含2Mg2+)和0.1μL Tap(5U/μL)DNA聚合酶(TaKaDa,大连),用ddH2O补足10μL。PCR程序如下:94℃下5min,94℃下30s,55℃下30s,72℃下40s,35个循环;72℃下10min,4℃下保存。PCR产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染显色[6]。
1.2.4 分子标记多态性筛选及定位分析
(1)多态性筛选:
     利用本实验室的公共引物(表1)对Dular和W9142两个亲本进行多态性筛选,Dular带型记为“1”,W9142的带型记为“2”,将具有多态性的标记记录下来,用于下一步连锁分析和初定位。
(2)连锁分析:
     将配制的W9142和Dular杂种F1上结实的种子磨成糙米,随机选取22个明显具有突变表型的糙米,将糙米催芽、浸种,然后种入土钵中,在培养箱内种植,提取苗期的DNA作为连锁分析的小群体,杂交组合的双亲Dular和W9142作为对照,用上述筛选到的多态性引物对这22个单株进行连锁分析。籼稻品种Dular的带型记为“1”,而突变体的带型记为“2”,杂合的带型记为“3”。聚丙稀酰胺电泳后,把不同引物的带型,记录下来进行分析。如果某个标记带型均为“2”,或者大多数为“2”,极少数为“3”;且其附近的标记带型均为“2”,或者大多数带型为“2”,极少数带型为“3”,则表明突变基因在该标记附近,该标记与基因有连锁现象,随后进一步扩大群体至46株验证是否与该标记连锁。
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