灰飞虱线粒体基因组适应性进化(3)
线粒体DNA长期以来被认为是中性遗传的，认为线粒体DNA上基因的突变对生物个体既无利也无害，然而线粒体在生命活动中发挥非常重要的功能，线粒体DNA上13个功能基因编码的蛋白均参与氧化磷酸化作用，而氧化磷酸化又是能量代谢的基础。有学者认为，mtDNA 在各个现存物种中都受到强烈的负选择压力以去除有害突变[8][9]。研究者逐渐发现线粒体DNA在分子上的变异偏离了中性遗传[10][11][12][13][14]，而且在自然种群中mtDNA单倍型还随着环境因素出现非随机分布现象[15][16]。总而言之，线粒体DNA中性选择学说屡遭质疑，但由于线粒体DNA的遗传特性，使得它比任何单独的核标记在分子生物学中更加有优势，线粒体DNA不能作为单一的分析手段，在对物种分类与进化，体种群遗传等进行研究时，应将mtDNA分析结果与物种的地理分布，形态、生理特征、栖息的地理环境等因素综合起来考虑。多方面寻找证据来全面探讨物种的起源和进化。
1 材料与方法
1.1 供试虫源
22个灰飞虱的地理种群的采集
分别在2010、2011、2012年5月至8月期间采样。我们共采集了22个灰飞虱的地理种群，横跨了中国四个温带（MT：中温带，WT：暖温带，NS：亚热带北部，SS：亚热带南部）。其中哈尔滨、丹东、延吉、合肥四个地点在两年内采集两次，各采样地点距离138-3071 Km不等。灰飞虱经过两天的饥饿处理后，立刻放入装有无水乙醇的冻存管中，带回实验室在-20℃条件下保存。
1.2 DNA提取
将HGI，HGII单倍型灰飞虱雌虫分别放在已编号的1.5ml离心管中，使用DNeasy®Blood &Tissue (QIAGEN)试剂盒提取灰飞虱DNA。
1.3 全线粒体基因组的扩增
根据zhang(2013)对灰飞虱线粒体基因组的测序结果，将全长16kb左右的线粒体全基因组分为两段（1:COI-CYTB:2:COII-ND4），基于这两段序列分别用primer6.0设计引物，经过检测，最终选出2对扩增结果比较好的引物，引物信息见表1-1：
表1-1 灰飞虱线粒体基因组扩增引物信息
Table1-1 primer sequence of mitochondrial genome amplification in SBPH
Fragment qPCR primer sequence (5’–3’) Product size (kb)
COI-CYTB COIF: TCTCATTACATATCGCTGGAGTTAG ~9
CYTBR2:CGTAAAATAGCGTAGGCAAATAG
ND4-COII ND4F:ACTCCGAGTTCCTAAACGATCA ~8
COIIR: GCTCCACAAATTTCTGAGCA
以楚雄(CX)和哈尔滨(HRB)种群的两种单倍型灰飞虱的DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系及条件如下，扩增结果表明ND4-COII这对引物在以CXT样品的DNA为模板时扩增不出现条带，在优化PCR条件及体系后，依然无法扩增出这段片段，针对这种情况，我们又重新设计引物，因此，用来扩增楚雄单倍型HGII个体线粒体基因组的ND4-COII这段的引物是：
ND4F1: 5’-CTACATGAGCTTTGGGAAGCCAA-3’;
12SR: 5’-CAGCATTCGCGGTTACACAT-3’
1.4 PCR产物检测，纯化及质量检测
1.4.1 PCR产物的电泳图谱
取3μl PCR 产物，加1μl 6x loading buffer，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结果如图1-1 ,1-2
图1-1 HGI单倍型灰飞虱个体线粒体基因组扩增结果电泳图，Marker: Hind III
Figure 1-1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of HGI mitogenomes, Marker: Hind III.
图1-2 HGII单倍型灰飞虱个体线粒体基因组扩增结果电泳图，Marker:Hind III
Figure 1-2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of HGII mitogenomes, Marker: Hind III.
1.4.2 PCR产物的纯化
为了提高PCR产物的纯度，我们使用QIA quick纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，具体步骤如下：
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