灰飞虱线粒体基因组适应性进化(4)
1. 将40μlPCR产物和Buffer PB按体积比1:5加入，混匀；
2. 在混合液中加入10μl 3M sodium acetate, pH5.0调节溶液的PH；
3. 将QIA quick spin column放在2ml的collection tube上，在spin column中加入样混合液，13,000rpm离心45s；
4. 舍弃底部收集管中的液体，加入750μl Buffer PE，13,000 rpm离心45s；
5. 将spin column放在新的2ml collection tube上，13,000 rpm离心1min；
6. 将spin column放在干净的1.5ml离心管中，加入50μl 无RNA酶水，13,000 rpm离心1min。收集到的液体即为纯化后的PCR产物。
1.4.3 PCR纯化产物的质量检测
用NanoDrop 紫外或可见光光度计对于QIAGEN试剂盒所纯化的PCR产物质量进行了检测。测定280、320、230、260nm下吸光度，它们分别代表核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般看R（OD260/OD280）值，当R≈1.80时，说明纯度是较高的。测定结果显示，当PCR产物纯化后，R值均在1.85-1.90之间，OD260/230的值在2.60-2.70之间。
1.5 线粒体基因组的测序
将扩增的线粒体DNA片段进行纯化后，送往北京诺禾致源公司测序。
1.6 线粒体基因组拼接分析
使用Geneious 8.0软件拼接线粒体基因组的高通量测序结果，基因组的拼接以NCBI已提交的线粒体基因组的序列作为参照，拼接采用默认参数。
1.7 线粒体基因组选择压分析
利用DNASP软件对20个HGI和20个HGII单倍型灰飞虱进行DNA多样性分析、同义突变和非同义突变的统计、和Tajima’s D的检测。
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