目前,噬菌体相关研究越来越受到人们的重视[6]。目前噬菌体微生态制剂在兽医学、医学、食品业、养殖业、环境控制等领域已经广泛地应用[7]。
2 实验部分
2.1 实验器材
仪器设备:250ml三角瓶、中试管、小试管、培养皿、玻璃涂布器、200ul枪头、50ul枪头、10ml离心管、移液枪、无菌滤器(孔径0.22um)、50ml针筒、恒温水浴锅、恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、冷冻离心机、摇床。
试剂:指示菌大肠杆菌、牛肉膏蛋白胨液体培养基、含琼脂0.7%半固体培养基、含琼脂2%的半固体培养基、污水、无菌水等。
2.2 实验步骤
2.2.1材料
菌种:
    敏感指示菌(大肠杆菌):周口师范学院实验室;
大肠杆菌噬菌体(从生活污水中分离):
    分别从污水河,公园湖水、地面、水池、校外污水河采集水样各500ml备用
培养基:
普通液体牛肉膏培养基:蛋白胨1g,牛肉膏0.3g,NaCl 0.5g,加蒸馏水定容至100mL;
三倍牛肉膏蛋白胨培养液:胰蛋白胨3g,牛肉膏 0.9g,NaCl 1.5g,加蒸馏水定容至100mL;
固体牛肉膏蛋白胨培养基:100mL液体牛肉膏培养基中加入1.5g琼脂粉;
半固体牛肉膏蛋白胨培养基(上层):100mL液体牛肉膏培养基中加入0.7g琼脂粉,即含琼脂0.7%;
下层(含琼脂2%)肉膏蛋白胨固体琼脂培养基:每100mL液体牛肉膏培养基中加入1.5g琼脂粉;
各培养基均需在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
仪器和器具:
试管(10ml、20ml)、培养皿、移液管(1、5mL)、离心机、摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、250ml三角瓶、无菌玻璃涂布器、200ul枪头、50ul枪头、无菌滤器(孔径0.22um)、50ml针筒、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、离心管。
2.2.2噬菌体的分离
(1)大肠杆菌菌悬液的制备  取在37℃条件下培养18h的大肠杆菌斜面一支,加4ml已灭菌的蒸馏水冲下菌苔制成菌悬液。
(2)噬菌体的增殖培养  配制100mL三倍牛肉膏蛋白胨培养液,将培养液分成5份,分别放入250ml的三角瓶中,121℃高压蒸汽灭菌20min。将5份20mL水样分别加入三角瓶中,然后加入大肠杆菌悬液0.3ml,37℃条件下,110r/min培养24h。
(3)制备裂解液    24h后,将培养液以4000r/min离心20min。用无菌注射器取裂解液上清进行过滤除菌。采用0.22um一次性针式过滤器过滤到已灭菌的试管中,37℃培养过夜,以作无菌检查。
(4)确证试验    参照文献[8]采用单斑法    次日经无菌检查(没有变浑浊)没有细菌生长,因此,将滤液放4℃冰箱保存以作进一步证明噬菌体的存在。
(i)将培养18h后的大肠杆菌悬液进行梯度稀释,按10倍稀释法,移液枪吸取0.2mL大肠杆菌,注入一支装有1.9mL已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中,即稀释到10-1,依次稀释到10-5稀释度。于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上分别滴加一滴(150ul)大肠杆菌悬液,将菌液涂布成均匀的一薄层(灭菌玻璃涂布器),每个浓度平行做一个。
(ii)待涂布的菌液干后,用移液枪分散滴加几滴滤液于平板菌层上面,在平板的某一区域加一滴生理盐水做对照,并做好标记,于37℃恒温培养箱培养过夜。经多次实验失败再实验直至成功地分离出大肠杆菌噬菌体。经证实,只有校外污水河、水池样本在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑,经过以上实验证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。
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