噬菌体的分离纯化及其效价测定(2)
目前，噬菌体相关研究越来越受到人们的重视[6]。目前噬菌体微生态制剂在兽医学、医学、食品业、养殖业、环境控制等领域已经广泛地应用[7]。
2 实验部分
2.1 实验器材
仪器设备：250ml三角瓶、中试管、小试管、培养皿、玻璃涂布器、200ul枪头、50ul枪头、10ml离心管、移液枪、无菌滤器（孔径0.22um）、50ml针筒、恒温水浴锅、恒温培养箱、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、冷冻离心机、摇床。
试剂：指示菌大肠杆菌、牛肉膏蛋白胨液体培养基、含琼脂0.7%半固体培养基、含琼脂2%的半固体培养基、污水、无菌水等。
2.2 实验步骤
2.2.1材料
菌种：
敏感指示菌（大肠杆菌）：周口师范学院实验室；
大肠杆菌噬菌体（从生活污水中分离）：
分别从污水河，公园湖水、地面、水池、校外污水河采集水样各500ml备用
培养基：
普通液体牛肉膏培养基：蛋白胨1g，牛肉膏0.3g，NaCl 0.5g，加蒸馏水定容至100mL；
三倍牛肉膏蛋白胨培养液：胰蛋白胨3g，牛肉膏 0.9g，NaCl 1.5g，加蒸馏水定容至100mL；
固体牛肉膏蛋白胨培养基：100mL液体牛肉膏培养基中加入1.5g琼脂粉；
半固体牛肉膏蛋白胨培养基（上层）：100mL液体牛肉膏培养基中加入0.7g琼脂粉，即含琼脂0.7%；
下层（含琼脂2%）肉膏蛋白胨固体琼脂培养基：每100mL液体牛肉膏培养基中加入1.5g琼脂粉；
各培养基均需在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
仪器和器具：
试管（10ml、20ml）、培养皿、移液管（1、5mL）、离心机、摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、移液枪、250ml三角瓶、无菌玻璃涂布器、200ul枪头、50ul枪头、无菌滤器（孔径0.22um）、50ml针筒、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、离心管。
2.2.2噬菌体的分离
（1）大肠杆菌菌悬液的制备 取在37℃条件下培养18h的大肠杆菌斜面一支，加4ml已灭菌的蒸馏水冲下菌苔制成菌悬液。
（2）噬菌体的增殖培养 配制100mL三倍牛肉膏蛋白胨培养液，将培养液分成5份，分别放入250ml的三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。将5份20mL水样分别加入三角瓶中，然后加入大肠杆菌悬液0.3ml，37℃条件下，110r/min培养24h。
（3）制备裂解液 24h后，将培养液以4000r/min离心20min。用无菌注射器取裂解液上清进行过滤除菌。采用0.22um一次性针式过滤器过滤到已灭菌的试管中，37℃培养过夜，以作无菌检查。
（4）确证试验 参照文献［8］采用单斑法 次日经无菌检查（没有变浑浊）没有细菌生长，因此，将滤液放4℃冰箱保存以作进一步证明噬菌体的存在。
（i）将培养18h后的大肠杆菌悬液进行梯度稀释，按10倍稀释法，移液枪吸取0.2mL大肠杆菌，注入一支装有1.9mL已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-5稀释度。于牛肉膏蛋白胨琼脂平板上分别滴加一滴（150ul）大肠杆菌悬液，将菌液涂布成均匀的一薄层（灭菌玻璃涂布器），每个浓度平行做一个。
（ii）待涂布的菌液干后，用移液枪分散滴加几滴滤液于平板菌层上面，在平板的某一区域加一滴生理盐水做对照，并做好标记，于37℃恒温培养箱培养过夜。经多次实验失败再实验直至成功地分离出大肠杆菌噬菌体。经证实，只有校外污水河、水池样本在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，经过以上实验证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。
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