拟南芥NaKR2超表达转基因株系的构建(2)
1.2.5. 反转录 8
1.2.6. PCR 9
1.2.7. PCR产物纯化回收（试剂盒） 9
1.2.8. 酶切 9
1.2.9. 连接 10
1.2.10. 转化 10
1.2.11. 菌落PCR鉴定重组质粒、酶切验证 10
1.2.12. 测序 11
1.2.13. 质粒电击转化农杆菌 11
1.2.14. 拟南芥浸润法转基因 12
1.2.15. 基因组DNA的简易提取方法 12
2. 结果与分析 13
2.1. PCR结果 13
2.2. 酶切验证结果 13
2.1.1. 挑单克隆PCR结果 14
2.1.2. 酶切验证结果 14
2.1.3. 测序结果 14
2.2. 讨论 16
2.2.1. 未提出质粒或质粒得率较低的原因 16
2.2.2. 加入Buffer P2后溶液没有变澄清的原因 16
2.2.3. 电泳无条带的原因 16
2.2.4. 大肠杆菌转化后涂布培养没有或极少菌落的原因 17
参考文献 17
致谢 19
引言
拟南芥 （Arabidopsis thaliana）是一种十字花科植物，属于被子植物门，双子叶植物纲。广泛分布于非洲西北部和欧亚大陆。在我国的内蒙、新疆、甘肃、陕西、西藏、江苏、山东、安徽、四川、湖北、云南等省区均有发现。植株较小，高度只有30厘米左右，生长周期短，（从播种到收获种子约4-6周），结籽多。基因组是目前已知植物中最小的，只有5对染色体。形态特征简单，使得突变表型易于观察，且为自花授粉，基因高度纯和，用理化因素处理后突变率较高，容易获得各种突变型。被广泛应用于发育生物学、植物遗传学和分子生物学的研究，是一种典型的模式物。
nakr1编码一种重金属协调蛋白
在以往的研究中，nakr1被定位在5号染色体的顶端90 kb的区域内（514.5～604.6 kb）。为了识别突变，利用基因芯片技术进行基因缺失定位。从2个种群中制备基因组DNA(nakr1-1突变体和Col-0)并与拟南芥ATTILE 1.0R arrays.杂交。一个7 bp缺失被确定在At5g02600，这个缺失导致移码突变和C-末端183个氨基酸的过早截断.用含有2817个碱基的基因组结构一个689 bp的启动子和59个非编码区(UTR)改造nakr1-1，所有外显子和内含子，终止密码子后的1005个核苷酸序列补充根系生长缺陷以及Na+，K+，和Rb+过度积累的表型。这也证实了NaKR1基因的身份。
NaKR1的HMA域分别和拟南芥铜伴侣ATX1 和 CCH共有47 和 45%,同一性。在酵母中的同源物（酿酒酵母）ATX1已经有很好的表征，在通过专门向重金属P型ATP酶提供铜来保持铜平衡的酶和防御氧化应激中都有发现。当酵母菌株中过度缺乏超氧化物歧化酶基因SOD1，AtATX1 和 At-CCH都可以以铜依赖的方式保护突变体的活性氧毒性。
为了测试可能的金属结合，NaKR1作为融合麦芽糖-结合蛋白质在大肠杆菌中表达(MBP)。纯化的融合蛋白的MBP-NaKR1身份经质谱分析证实。对四十个独特的肽进行检测，覆盖了融合蛋白序列的48.5%。在纯化的蛋白质样品中通过ICP-MS分析检测到几种重金属。mbp-nakr1融合蛋白与MBP控制相比较有较高的Zn、Cu、Fe、Ni、CO。蛋白质与金属的摩尔比为3:1左右，表明nakr1是金属结合蛋白。变异版本的nakr1全基因构建在HMA域的两个保守的半胱氨酸残基上，这两个保守的Cys残基转变为甘氨酸，使得未能补充nakr1-1短根和晚花表型。这表明，在植物中NaKR1的金属结合功能是必不可少的。