微生物肥料是指利用微生物或其代谢物作用促进作物生长的一种制品，是一种新兴的肥料。20世纪化学肥料使用广泛，粮食总产的1/3均源于其的贡献。如果没有化学肥料，那么全球作物产量将减少50%左右[6]。虽然化学肥料对粮食生产的作用巨大，但是其广泛的使用对环境所造成的污染也有目共睹，并且不能小觑。而微生物肥料具有无毒、无害、无污染的优点，很好的弥补了化学肥料的不足。并且生物菌肥在施用过程中，可产生有益微生物从而活化土壤养分，提高土壤肥效，优化土壤结构，改善土壤理化性质[7]，避免了长时间一直施用化学肥料造成的环境污染、土壤板结、作物品质下降等问题。因此，微生物肥料的开发与应用是发展持续农业的重要研究领域之一，拥有广大的发展空间[6]。并且孙玉良[8]等发现一定稀释倍数的微生物菌肥有利于黄瓜幼苗的生长，薛宏德[7]等发现微生物菌肥对花生产量增产明显。而甘薯(Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill)是一种世界性粮食作物，其用途广泛，营养价值高，具有防癌保健作用，被誉为“抗癌之王”。中国是世界上最大的甘薯生产国，因此，提高甘薯产量是甘薯产业可持续发展的关键，现已有研究甘薯的不同的种植模式[9]、氮磷钾的分期施用[10]、AM真菌[11]、氮磷钾施肥的比例等等变量因素对甘薯产量与品质的影响。本文通过分离鉴定徐州汉王甘薯田的土壤微生物，并探究其对甘薯苗生长的影响。

本文采用微生物纯培养方法，通过16SrDNA测序方法对徐州汉王某甘薯地土壤微生物进行了分离与鉴定，并探究其对甘薯苗生长的影响。主要技术包括土样采集、菌种分离与纯化、PCR、胶回收、16S rDNA测序，采用EzTaxon 软件对基因库中基因序列进行同源性比较,采用MEGA5.0软件对相似性序列进行系统发育分析研究并构建系统发育树分析菌种的同源性，植物组织培养技术等。希望找出能够生产利于甘薯苗生长或提高甘薯生长质量的菌肥的土壤微生物原料，用于甘薯种植，从而使甘薯产量、质量提高，发展生态农业。

2  材料与方法

2.1  土壤采集区概况

汉王镇，位于徐州的西南部，其与安徽的群山相接壤，东部紧邻徐州铜山新区，与铜山新区相距9公里，汉王镇总面积约62平方公里，镇上群山起伏，绿树葱葱，布满山林，小镇还有河流穿过，景色优美怡人。汉王镇还有“花果之乡”之称，镇上农田果园遍布，甘薯、豆角、杏子、葡萄等等。

2.2 样品采集与处理

2013年10月20日，在徐州汉王某甘薯田的三个不同区域的甘薯的根系旁，距离土壤表面约10cm处，采集土壤样品，分别装入无菌的聚乙烯袋中密封并编号记录，样品带回实验室后用孔径为2 mm×0.25 mm的钢筛筛去大块的土壤团块，重复筛选三次，得到细小的土壤颗粒，于4 ℃冰箱中保存备用，用于土壤微生物分离纯化实验。

2.3 实验器材

无菌的聚乙烯袋、钢筛、烧杯、培养皿、摇床、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、移液枪、接种环、玻璃刮刀、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪、水浴锅、离心机、电子天平、电磁炉、超净台、锥形瓶、紫外成像仪等。

2.4 主要试剂及引物

LB固体培养基：氯化钠、蛋白胨、酵母粉、琼脂粉；

MS培养基：MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液、MS有机物母液源!自`优尔'文"论(文`网[www.youerw.com、蔗糖、琼脂；

PCR反应体系：2*Taq Master Mix、ddH2O、通用引物F27： AGAGTTTGATCATGGCTCAG、通用引物R1492：CTACGGTTACCTTGTTACGAC；

琼脂糖凝胶：琼脂糖、Goldviewna ITM 型染料、1X TAE；