1 试验材料和方法

1.1 试验材料

在线上核苷酸序列库中查找提取相关物种的Tas1r3序列，本试验中所用到的外显子序列涉及的物种有：人、老鼠、亚马逊帆鱼、变色蜥蜴、穿山甲、猫、洞穴鱼、鸡、黑猩猩、中华鳖、鳕鱼、腔棘鱼、狗、鸭、雪貂、捕蝇鸟、河豚、大猩猩、豚鼠、刺猬、长鼻袋鼠、猕猴、狨猴、青鳉鱼、狐蝠 、狒狒、袋獾、红毛猩猩、熊猫、猪、鼠兔、新月鱼、 大鼠、斑点雀鳝、松鼠、棘鱼、绿河鲀、火鸡、绿长尾猴、斑马雀、斑马鱼、马、海豚、鼠狐猴、小袋鼠、蹄兔、羊、丛猴、负鼠、大象。

1.2试验步骤

（1）在NCBI上查找牛的Tas1r3序列；

（2）在genebank中下载完整的牛的Tas1r3序列并保存；

（3）提取牛Tas1r3六号外显子序列；

（4）将提取好的Tas1r3六号外显子序列在整个序列库中进行BLAST序列比对；

（5）提取BLAST结论中序列保守性高于60%的物种序列，同样找到Tas1r3的CDS区，检验其编码的起始序列是否为AUG（是则为正向编码，不是则为反向编码需从CDS区的末尾开始提取）；

（6）分别下载保存其mRNA序列；

（7）使用名为DNAstar的软件包中的seqman程序来进行基因序列的拼接和编辑。（一般而言，为了保证出现的最终结果即拼接和编辑后的Tas1r3序列能表现出一定的准确性，其基因重叠的长度应该在50个碱基以上。）

（8）利用软件中的seqman功能将现有的序列进行剪切【8】，主要原则是评价序列结果中的信号强弱，最终对信号比较弱的两端序列进行合理剪切，整个过程由该程序自动运行生成，剪切对象也是程序自动进行选择并编辑的结果，编辑结束后可以确定拼接序列的方向；

（9）选择能测通整个反应的序列，找出引物序列并以此确定所有序列的方向；

（10）把不同的序列按物种分类并分别保存为seq文件的格式。使用clustalx软件的比对功能将序列中的保守区域对齐并校对，完成比对之后，使用bioxmsetup26软件再次调整序列的长度、删除空格，由于密码子含有三个位点，其每一个的进化速率都不相同，经过此次调整，我们使其目标序列的首个碱基可以确保出现在三联体密码子的位置上。以提高发育树构建的准确性和成功率【9】；

（11）打开将修饰过的MRNA序列添加在框内，点击按钮开始翻译；

（12）人工筛选翻译出的氨基酸序列（选取最长的描红区域）保存在txt文件中；

（13）将text文件修改成fasta格式序列文件；

fasta格式示例：核酸序列：>sequence1_物种名称

                          GGATCCTGACGATGAACGCT

              氨基酸序列：>sequence2_物种名称

                           MGTPINSFRKALAEGKTQIGF

（14）用clustalx软件转化成FASTA模式；

（15）安装打开mega软件，选取原有的FASTA模式文本转化成MEGA模式；

（16）本试验中我们使用多种方法来构建生物系统发育树，多重结果校对后取最终结果源!自`优尔'文"论(文`网[www.youerw.com，可以最大程度的保证该发育树的准确性、可靠性。一般情况下，我们通常使用的是：1最大似然法（这种方法也称为最大概似估计）2邻接法(Neighbour-Joining）；

（17）参照NCBI中己知的脊椎类动物等近缘物种的相应基因序列表，用clustalx软件将基因全序列进行比对，然后采用软件用邻近法(Neighbour-Joining）构建分子进化树来进行系统发育分析；