致 谢 20

1 前言

植物纤维素约占植物体干重的33.4%～50.0%，是地球上最丰富的有机物质。但是，由于纤维素中存在许多高能的氢键，因此其水解、利用均很困难。世界上平均每年约生成1 500～2000亿吨植物性有机物，其中约有一半为纤维素类物质，而能利用的只有一小部分，绝大部分都被弃置[1]。因此，如何更有效地开发和利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。

然而，生物能源利用最主要的问题就是纤维素的降解。为了更好的利用纤维素，则需要大量的纤维素酶，但是纤维素酶的应用成本相对较高[2]，如何开发低成本的纤维素酶仍在探索中。由于真菌所产的纤维素酶多为胞外酶，便于分离和提取且产酶效率较高，利于纤维素酶的工业化制备及其应用，因此研究和生产中采用的菌种大多是木霉、曲霉和青霉

等真菌，其中绿色木霉应用最广[3]。但目前多侧重于真菌对可溶性纤维素或经耗资较大且容易造成再次污染的物理、化学等方法预处理后的不溶性纤维素的作用，而对未经处理的天然纤维素作用研究较少，不能有效地转化和利用天然纤维素特别是农作物秸秆这一丰富资源。因此，不断地筛选高效利用天然纤维素的野生菌株并应用于生产对纤维类资源的利用具有重要意义。本实验的目的就是想通过筛选出能高效降解还原糖的纤维素降解菌从而为后期的大规模生产纤维素酶奠定基础。

纤维素酶是降解产生纤维素的一组酶的总称，能降解和利用纤维素的微生物大致可分为真菌类和细菌类。纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富的可再生资源。纤维素酶包括内切葡聚酶(EG)、外切葡聚酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)三种酶 [4-5]。纤维素酶的3类组分对纤维素的确切酶解机制还不完全确定，目前，普遍接受的纤维素的降解机制是协同作用模型，即CBH酶破外纤维素的结晶结构，作用于不溶性纤维表面，使纤维素结晶链开裂，长链纤维素分子末端部分游离和暴露，使纤维素易于水化，经CBH酶作用后的纤维素分子结晶结构被破坏，EG酶即吸附在纤维素分子上面，从键的内部任意位置切开β-1,4-糖苷键，将纤维素分子断裂为纤维二糖和纤维三糖等[6-7]。最后这些被裂解产物由β-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖。部分细菌和真菌具有纤维素酶活性，但需要较高的工作温度，因此，人类对纤维素的利用十分有限。

DNS法，即二硝基水杨酸(DNS)法，是利用碱性条件下，DNS与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的[8]。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。本实验用DNS法测定纤维素降解菌的酶活，为纤维素酶的酶活比较提供理论基础。

2 实验材料与方法

2.1 菌种

纤维素降解菌由之前筛选并由实验室保藏，编号分别是NF 16-3、NF 16-1、NF 6-1、NF 5-2和NF 7-2。

2.2 培养基[8]

2.2.1  纤维素培养基

固体培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）5 g，硫酸铵2 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，硝酸钠1 g，蛋白胨0.5 g，酵母膏0.5 g，琼脂20 g，定容至1L。

液体培养基：CMC-Na 5 g，硫酸铵2 g，磷酸二氢钾1 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钠0.5 g，硝酸钠1 g，蛋白胨0.5 g，酵母膏0.5 g，定容至1L。