众所周知,在非生物胁迫条件下植物会产生过量的乙烯,导致根系生长受到抑制,进一步抑制了植物的生长,使植物的系统抗病性降低[3]。生防菌木霉的ACCD酶能够切断植物激素乙烯的前体ACC产生酮戊二酸和氨,降低植物乙烯含量,进而促进植物生长,提高植物的抗病性。因此,ACCD在生物防治中具有广泛的应用前景[4]。
本实验采用硫酸铵分级沉淀技术[5],在最适硫酸铵饱合度下收集ACCD酶,SDS-PAGE胶分析ACCD酶的纯度,然后将分离纯化到的ACCD酶用来处理大豆植株,分别在15d,30d,60d观察在不同浓度的ACCD酶的条件下,植株的生长情况以及抗病情况。从而了解ACCD酶作用于大豆的最佳浓度。在此基础上观察了解ACCD酶的作用及功能。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试大豆,由周口师范学院生命科学与农学学院提供。木酶由本实验室分离保存,将保存的木霉菌株进行活化,分离、提纯以得到ACCD酶。
培养基:SM无铵培养基和SM培养基。
药品:甲苯;二硝基苯肼;0.56N Hcl;0.2N Hcl;0.2N NaoH;ACC;30%过氧化氢;KH2PO4溶液;磷酸缓冲液; 30%Acr(Acr/Bis);10%的SDS溶液;10%的过硫酸铵溶液;四甲基乙二胺(TEMED);1.5M Tris(PH8.8);1.0M Tris(PH6.8);0.2M Tris (PH6.8);1%SDS;30%甘油;巯基乙醇;溴酚兰;0.15%考马斯亮蓝R250溶于脱色液中(脱色液:50%的甲醇,7%的冰醋酸的水溶液)。
1.2 试验设置与处理
1.2.1采用硫酸铵分级沉淀技术分离出木霉的ACCD酶:将实验室保存的木霉菌株进行活化,代谢物过滤后采用硫酸铵分级沉淀法,在最适硫酸铵饱合度下收集ACCD酶,SDS-PAGE胶分析ACCD酶的纯度,并将该酶切胶回收。
1.2.2 ACCD酶处理大豆四个真叶的幼苗:将分离纯化到的ACCD酶处理大豆植株,组培苗生根之前用不同浓度的ACCD酶处理,15d,30d,60d分别统计根的伸长情况,通过测定根长、株高、茎粗、干重和湿重,以及POD、SOD等抗性指标分析ACCD酶促进大豆生长情况以及提高系统抗性情况。
1.3 仪器和设备
TG16台式高速离心机:湖南仪器仪表总厂离心机厂;
AL204电子天平:梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;
SW-CJ-2FD洁净工作台:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;
LDZX-40KBS型立式电热压力蒸汽灭菌锅:上海申安医疗器械厂;
HH-S型水浴锅:巩义市英峪予华仪器厂;
Spectrumlab22PC分光光度计:上海棱光技术有限公司;
HPX-9162 MBE 数显不锈钢电热培养箱:上海博讯实业有限公司医疗设备。
1.4 ACCD酶的分离纯化
1.4.1 活化木酶菌株
从4℃冰箱中取出保存的木酶,接种在SM培养基中,在28℃的恒温摇床中培养48小时备用。
1.4.2 收集菌丝
将培养48小时的木酶菌的菌丝在超净台中冲洗,然后接入到SM无铵培养基中备用。
1.4.3 ACCD酶的诱导分离和纯化
在之前得到的含有木酶菌丝的培养基中分别加入0.0005g/ml、0.001g/ml、0.0015g/ml、0.002g/ml、0.0025g/ml、0.003g/ml的ACC,诱导培养的最后阶段。培养物重悬于1/2体积的Tris缓冲液中(0.1M PH=8.5),并匀浆。
25μL甲苯加入到200μL试剂中,充分漩涡30s,加入20μL ACC(0.5M),30℃温浴15min,加入1ml 0.56N的HCL,裂解物离心10000g 10min,取1ml上清液用800μL 0.56N的HCL混匀,加入300μL的二硝基苯肼,加入2ml 2N的NaoH后,30℃温浴30min,然后在A540nm处测出OD值。
然后用SDS-PAGE胶分析ACCD酶的纯度,用两块电泳玻璃板制成垂直板槽(不能漏胶),垂直放置。将配制好的分离胶溶液,倒入,滴加入无离子水,待凝胶聚集后,倒出无离子水,用吸水纸吸干,倒入浓缩胶,再插入梳子。然后分别取样品2ml于离心管中,按1/2比例加入10ml缓冲液,再沸水浴中加热5min,取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30ul不同浓度的标准蛋白样品和试验样品注入样品槽。点样结束后,调节电泳仪电流到10mA(2-3mA/em),保持电流稳定不变,当溴酚蓝迁移到离分离胶底1-2cm时,即可停止电泳。电泳完毕后,取出凝胶板,浸入染色液中,在37℃温箱中保温过夜。倒掉染色液,24h后,即可看到清晰的蛋白质条带。
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