1.5 大豆生长指标的测定
大豆所测的生长指标包括株高、茎粗、干重和湿重。株高与茎粗采用细线与直尺相配合的方法进行测量。利用水遇热为水蒸气的原理,可用加热烘干法来测定植物组织的干重与湿重。
1.5.1 大豆株高、茎粗的测量
1.5.1.1 操作步骤
每盘轻拔出若干大豆幼苗,分别用细线量出大豆株高的长度,并在细线上做好标记,然后用直尺测出所做标记的细线长度,并得出每盘大豆的平均株高。把每盘所取的若干大豆横切,排成一排,测其直径总和,再计算出每株大豆的茎粗。
1.5.2 大豆干重、湿重的测定
1.5.2.1 操作步骤
(1)称量瓶的恒重:将洗净的8个称量瓶编号,放在105℃恒温烘箱中,烘两个小时左右,用坩埚钳取出放入干燥箱中冷却至室温后,在天平上称重。再于烘箱中烘两个小时,同样于干燥箱中冷却称重,如此重复两次(两次称重的误差不得超过0.002g),求得平均值为W1。
(2)将待测大豆真叶从植株上取下后迅速剪成小块,装入已知重量的称量瓶中盖好。在分析天平上准确称取重量,得瓶与鲜样品总量为W2,然后于105℃烘箱中干燥4~6小时(注意要打开称量瓶盖子)。取出称量瓶,待其温度降至60~70℃后,用坩埚钳将称量瓶盖上,放在干燥器中冷却至室温,再用分析天平称重,这样重复几次,直至恒重为止。称得重量是瓶与干样品总重量为W3。
1.5.2.2 结果计算
样品湿重(鲜重):Wf =W2-W1
样品干重:Wd=W3-W1
1.6 大豆生理指标的测定
所测大豆的生理指标有POD、SOD、CAT活性。POD活性测定采用愈创木酚法[6],SOD活性测定采用连苯三酚自氧化法[7],CAT活性测定采用紫外分光光度测量法[8]。
1.6.1 POD活性的测定
1.6.1.1 实验试剂
0.02mol/L KH2PO4溶液,0.1mol/L、pH6.0磷酸缓冲液,反应混合液:取0.1mol/L、pH6.0磷酸缓冲液50mL,加入愈创木酚8mL,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入30%过氧化氢9mL,混合均匀,于冰箱中保存。
1.6.1.2 操作步骤
(1)粗酶液的制备:20μL孢子悬浮液接种到10ml SM培养基中培养48小时。得到的菌丝冲洗后接入到SM无铵培养基中,分别加入0.0005g/ml、0.001g/ml、0.0015g/ml、0.002g/ml、0.0025g/ml、0.003g/ml的ACC,诱导培养的最后阶段。培养物重悬于1/2体积的Tris缓冲液中(0.1M PH=8.5),并匀浆。
(2)大豆样品过氧化物酶活力的测定:取出比色杯,已知加入混合液3mL和0.02mol/L KH2PO4溶液1mL,作为调零空白;另一只加入反应混合液3mL和上述粗酶液1mL,立即开启秒表计时,于分光光度计470nm处比色测定吸光度,每隔30s读数一次。
1.6.1.3 结果计算
以每分钟内OD470变化0.001g/ml为1个过氧化物酶活力单位(1U),计算大豆材料过氧化物酶的活力。
POD活力(U/g,FW/min))= (∆OD470×VT)/(0.001g/ml×W×VS×t)
式中:OD470:反应时间内吸光度的变化;W:大豆材料的鲜重(g);t:反应时间(min);VT:提取液的总体积(mL);VS:测定时取用酶液体积(mL)。
1.6.2 SOD活性的测定
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