酶法合成头孢羟克洛的路线

Fig.1 The general scheme for IPA catalyzed synthesis of hydroxycefaclor

近年来一些抗生素的结构改造成为对抗耐药菌的出现的发展现有抗生素的方式之一。例如，红霉素的衍生物克拉霉素是日本大正公司于1982年成功开发的第二代大环内酯抗生素，它是红霉素C-6位羟基甲基化后得到的衍生物，于1991年获FDA批准在美国上市[5]。大正公司应用化学法对红霉素进行的改造，取得了良好的效果；但是，其改造过程复杂、步骤繁多、杂质产物增多和能耗较高。生物技术的快速发展，生物酶法合成抗生素成为一种可行的方法。酶法成功一步合成氨苄西林[6]，不仅过程简单，能耗低，而且每个批次反应时间相对化学法大大缩减。 另外，酶法合成的氨苄西林在嗅觉和觉方面都优于化学法氨苄西林。酶法技术可延长活性成分的有效期，由于该法的高稳定性；因此，在药典的规定范围内进行的成分化验表明，其拥有更长保存期[7-8]。本文采用头孢母核7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸（7-ACCA）和侧链D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐（4-OH-PGMG）作为反应底物，在固定化青霉素酰化酶（IPA）催化作用下合成头孢羟克洛（暂时命名）反应原理路线如图1所示；并研究有机溶剂种类、溶剂浓度、体系pH、反应温度和母核与侧链的配比等参数对7-ACCA的转化率的影响，确定最佳的合成体系，为工业化生产头孢羟克洛提供必要的实验数据和理论支持。源:自*优尔`%论,文'网·www.youerw.com/

2 材料和方法

2.1 材料和仪器

7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸 湖北鑫源顺医药化工有限公司；D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐 深圳博泰尔生物技术有限公司；固定化青霉素酰化酶(IPA-750) 湖南福来格生物技术有限公司；三氯乙酸、乙酸、氢氧化钠、甲醇、正己烷和4-苯甲醛 国药集团化学试剂有限公司；乙二醇 江苏强盛功能化学股份有限公司；乙酸乙酯 南京化学试剂有限公司；氨水 无锡市亚盛化工有限公司。

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2.2 实验方法

2.2.1   头孢母核7-ACCA标准曲线的绘制

取反应液0.1 mL，加入0.4 mL的20%三氯乙酸（TCA）终止液，充分混匀后取0.1 mL上述已终止液稀释5倍后加入PDAB生色液3.5mL，充分反应5min后，于415nm条件下测定吸光度A415。其中生色液PDAB配置：精确称取0.25g对二氨基苯甲醛溶于50 mL甲醇中，加入40 mL乙酸和2M NaOH 2.5 mL的混合液，加蒸馏水稀释至350 mL，置棕色瓶保存。

2.2.2   确定合成体系的最佳有机共溶剂文献综述

在10 mM PBS反应体系中分别加入0.469g 7-ACCA(25mM)和1.31g 4-OH-PGME(75mM), 再加入有机共溶剂，调pH至6.0，维持反应温度在25℃，最后加入0.75g IPA；反应10h后测7-ACCA含量。本文，我们选择了常用的有机溶剂作为共溶剂，使用40%的正己烷、乙酸乙酯和EG分别作为反应缓冲液的组成成分。通过7-ACCA转化率确定最佳的有机共溶剂种类。

2.2.3   确定合成体系的最佳有机共溶剂浓度

在10 mM PBS反应体系中分别加入0.469g 7-ACCA(25mM)和1.31g 4-OH-PGME(75mM), 再加入最佳的有机共溶剂，调pH至6.0，维持反应温度在25℃，最后加入0.75g IPA；反应10h后测7-ACCA含量。设立的最佳有机共溶剂浓度为0%、20%、40%、60%，通过7-ACCA转化率确定最佳的有机共溶剂浓度。