目前,制造R-扁桃酸的方法主要包括:不对称合成法,光学异构体拆分法,生物合成法等[4]。对于生产高光学活性的扁桃酸,目前国内仍然采用非对映体盐结晶法[5]。这种方法由于成本高,手性拆分剂价格又昂贵,从而限制了手性扁桃酸的大批量合成。生物转化法可以选择性合成单一手性化合物,其产物又无需拆分,能够有效的降低成本[6]。已有研究称以外消旋扁桃酸为底物,通过筛选得到能选择性降解S-扁桃酸的短杆菌[7],该菌能把外消旋扁桃酸转化为R-扁桃酸。这种方法的最大收率不超过50%,但反应完全,成本低廉,同时也简化了分离工艺。近年来, 生物转化法合成R-扁桃酸在工业生产中开始应用。这种环境友好的生物技术方法, 越来越受到制药工业的重视,并成为研究的热点。

1.2 R-扁桃酸脱氢酶简介

有些菌种能产生R-扁桃酸脱氢酶,从而特异性降解培养基底物中的R-扁桃酸。目前,已有研究称从土壤中筛选得到了具有这种特性的菌种,但对它的酶学性质研究仍比较少。

国外对不同微生物来源的R-扁桃酸脱氢酶进行了分离纯化和性质研究,前人曾从粪链球菌(Streptococcus faecalis IFO 12964)[8]中分离出一种R-扁桃酸脱氢酶,它的亚基相对分子质量为34kDa,其酶为同型二聚体。后来从弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus DSM 20019)、红酵母(Rhodotorula graminis KGX 39)[9]中也分离得到了类似的R-扁桃酸脱氢酶。国内有研究报道称从土壤中筛选得到能选择性降解R-扁桃酸的菌种,鉴定为恶臭假单胞菌[10]、铜绿假单胞菌[11]。而且,在培养基中加入少量扁桃酸、苯甲酰甲酸或苯甲酸对恶臭假单胞菌产R-扁桃酸脱氢酶均具有一定的诱导效果,其中以扁桃酸的诱导效果为最佳,而它的酶催化反应最适温度为30℃。严芬[12]等从酿酒酵母中、何玉财[13]等从产碱杆菌(Alcaligenes ECU0401)中提取到R-扁桃酸脱氢酶,并对其理化性质做了一定的研究,其最适pH在6.0-6.5之间,稍偏酸性。

1.3  NADH氧化酶的分类和来源

1.3.1  分类

NADH氧化酶是一种氧化还原酶。这种酶能在有氧条件下把NADH氧化为NAD+,同时还原氧气为过氧化氢或水。NADH氧化酶可以根据氧气还原后生成的产物分为两类:一类是NADH过氧化酶,也称H2O2型NADH氧化酶(NOX-1),反应过程中转移2个电子;另一类是狭义的NADH氧化酶,也称H2O型NADH氧化酶(NOX-2),反应过程中转移4个电子。

1.3.2 来源

许多细菌中存在着NADH氧化酶的活力,Condon[14]早在1987年就提出乳酸菌中广泛存在着NADH氧化酶,并且指出,NADH氧化酶在乳链球菌中可能是首要的氧代谢酶。后来在球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、小球菌属(Pediococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)等22种乳酸菌种中都检测到NADH氧化酶的活性。在陆续的研究中发现,木聚糖双芽孢杆菌(Amphibacillus xylanus)、德氏乳杆菌德氏亚种(L. delbrueckii subsp. Delbrueckii)等微生物都具有H2O2型NADH氧化酶的活力;粪链球菌(Streptococcus faecalis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)等都具有H2O型NADH氧化酶的活性。而变异链球菌[15]则同时具有H2O2型和H2O型NADH氧化酶的活性。

1.4  NADH氧化酶的理化性质

1.4.1  相对分子质量

大多数的NADH氧化酶为同源二聚体,相对分子质量在92-112kDa。NADH氧化酶除了有单体蛋白和二聚体以外,还有三聚体、四聚体和六聚体等[16]。不同种类的NADH氧化酶,它们相互间的相对分子质量差异也是比较大的。

1.4.2  最适温度及热稳定性

升高温度既能加速酶促反应的进行,使酶的活力增强;又能加速酶的变性,造成其失去活性。在某一温度范围内酶促反应速率达到最大,则称这一范围为酶的最适反应温度。多数微生物的NADH氧化酶的适宜温度范围为20–50℃。酶在最适温度条件下具有最大的催化反应速率。热稳定性酶具有提高化学反应速率,简化工艺,活性稳定,耐储藏等优点。目前已知存在少数嗜热菌的NADH氧化酶具有比较高的热稳定性。论文网

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