液体YPD培养基:葡萄糖20.0 g/l,酵母粉10.0 g/l,蛋白胨20.0 g/l,在115 ºC,灭菌30 min。

发酵培养基:葡萄糖 40.0 g/l(对照),(NH4)2SO4 0.25 g/l,KH2PO4 1.7 g/l,Na2HPO4 12.0 g/l,MgSO4·7H2O 1.25 g/l,酵母提取物0.25 g/l(对照)或玉米浆,硫胺素 0.006 g/l,蒸馏水 1.0 l。培养基配好后用浓盐酸调pH至6.0,115 ºC高温高压灭菌30 min,1.6% (w/v) 溴甲酚紫指示剂过滤除菌后,以100.0 l/50.0 ml培养基的剂量加入冷却的发酵培养基(当培养基中加入CaCO3时,无需再加指示剂)。文献综述

2.1.4 试剂

1.6% (w/v) 溴甲酚紫指示剂:称取1.6 g溴甲酚紫溶于100.0 ml 95.0% (v/v) 乙醇中,充分溶解。

2.0 M KOH溶液:称取11.2 g KOH溶于100.0 ml蒸馏水中,高温高压灭菌冷却待用。

柠檬酸测定试剂:

10.0% (w/v) HPO3:5.0 g HPO3充分溶于50.0 ml 9.0 M H2SO4中。

KMnO4-NaBr溶液:称取5.0 g KMnO4溶于80.0 ml蒸馏水中,再称量5.0 g NaBr溶于上述KMnO4溶液中,最后将溶液定容至100.0 ml。

3.0% (v/v) H2O2溶液:量取10.0 ml 30.0% (v/v) 的H2O2溶液,用蒸馏水定容至100.0 ml。

硼酸钠-硫脲试剂:准确称取4.0 g硫脲溶于蒸馏水中,并定容至100.0 ml。再准确称取2.0 g硼酸钠溶于上述硫脲溶液中,最后用硫脲溶液定容至100.0ml。

以上所用试剂均为分析纯

2.2 方法 

2.2.1 种子液培养

保种管内的菌种划线至YPD固体培养基,在28 ºC下恒温静置活化培养2~3天。挑取单菌落接种于液体YPD中,在28 ºC和180 rpm下振荡培养至菌体浓度达到OD600 nm=30.0左右。

2.2.2 发酵培养

柠檬酸发酵在发酵培养基中进行,发酵培养基中分别加入不同浓度的玉米浆,葡萄糖和CaCO3。对照组培养基分别以酵母提取物为氮源0.25 g/l,葡萄糖40.0 g/l,不加碳酸钙(以2.0 M KOH调pH)。

取1.0 ml(OD600 nm=30)种子液接种到50.0ml发酵培养基中,在28℃,180rpm下振荡培养。对照组培养过程中加入溴甲酚紫100 ml(1.6%)作为指示剂,以2.0 M KOH调节培养基pH,使发酵pH保持在6.0左右。

以优化后的发酵条件在5-l的发酵罐中扩大培养。发酵罐配置有碱泵,氧传感器,搅拌器,加热元件和温度传感器等元件。种子培养液准备如上述方法进行。取60.0ml的种子培养液(OD600nm=30.0)转移到1.5 l含有葡萄糖60.0 g/l, 玉米浆1.0 g/l, CaCO3 40.0 g/l的培养基中。在搅拌速度为250 rpm,通气速率为3.0 l/min/l,温度为28℃的条件下进行发酵培养,发酵时间288 h,培养期间每隔24 h收集20.0 ml培养物进行产物含量测定。源.自/优尔·论\文'网·www.youerw.com/

2.3 产物产量测定

柠檬酸含量则通过Camp 和Farmer报道的方法进行测定[10]。具体方法如下:

1)1.0 ml培养液于5000 × g离心5.0 min,取上清液稀释100倍后用于测定。

2)取1.0 ml稀释液于试管中,加1.0 ml HPO3(10%)冰浴。

3)取2.0 ml KMnO4-NaBr溶液加至上述试管中,冰浴10 min。

4)向试管中滴加3.0% H2O2,使管内溶液褪至无色。

5)取1.5 ml正庚烷加入试管中,充分振荡1分钟。静置分层后取1.0 ml上层有机相转至另一试管中。

6)在上步所取的1.0 ml有机相中加入3.5 ml硼酸钠-硫脲试剂,充分混匀1 min,静置10 min后 取3.0 ml下层溶液,445 nm测吸光值并通过标准曲线计算发酵液柠檬酸含量。重复测定3次取平均值。

空白对照:1.0 ml正庚烷 + 3.5 ml硼酸钠-硫脲试剂涡旋,取下层液体作为样品测定的空白对照。

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