结论 18

致谢 19

参考文献 20

1  前言

1.1  纤维素酶的概述

随着能源危机、食物短缺、环境污染等问题正日益严重地困扰着整个世界, 能源短缺问题已经成为制约经济社会的持续发展的关键[1]，寻找开发新能源、节省粮食、减少环境污染显得越来越重要。

植物细胞壁有三种基本的结构上的生物分子组成：纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素是地球上最丰富的生物高聚物，在组织中被认为是微晶结构。植物通过光合作用使光能以生物能的形式固定下来，其生成量每年高达2000亿吨，这些能量相当于全球人类每年能源消耗量的20倍，食物中所含的能量的200倍，是永远不会枯竭的可再生资源[2]。纤维素在一定条件下可以被水解成单糖，单糖可再通过微生物发酵生产各种有用的产品，如酿酒、纺织、饲料、燃料、农业、化工原料、食品、医药等[3]。在纤维素发酵产乙醇的过程中，分步降解纤维素并最后发酵成乙醇，纤维素酶起了至关重要的作用。论文网

1.1.1  纤维素酶的降解机制

纤维素是地球上含量最丰富的可再生利用的多糖,研究表明其完全降解至少需要3类酶系:内切葡聚糖酶( endo - glucanase) ,纤维二糖水解酶( cellobihydrolase)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4- glucosi2dase). 目前已从40多种细菌和5种以上的真菌中克隆到了纤维素酶基因,且大多数已获得全序列[4]。

葡聚糖酶是将葡聚糖降解为葡萄糖的一类水解酶。根据葡聚糖酶作用于糖苷键位点的不同，可分为β-1,2-葡聚糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶。根据切点位置的不同，又可分为外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶[5]。研究学者已发现的内切葡聚糖酶有5种: Cel7B ( EGⅠ)、Cel5A( EGⅡ)、Cel12A ( EGⅢ)、Cel45A(EGⅤ)和Cel61A (EGⅣ); 外切葡聚糖酶( 也称纤维二糖水解酶)有2 种: Cel6A (CBHⅡ)和Cel7A (CBHⅠ); β-葡萄糖苷酶有2 种: BGLⅠ和BGLⅡ[3]。

β-1,4-内切葡聚糖酶可特异性作用于β-1,4-葡萄糖苷键，使其内部的β-l,4-糖苷键水解，生成纤维二糖与纤维寡糖等短链低聚糖；β-l,4-糖苷键把这些短链低聚糖继续降解为两个葡萄糖分子[6]。

1.1.2  纤维素酶的性质

细菌产生的纤维素酶量少，主要是内切酶，大多数对结晶纤维素没有活性，而且不能分泌到细菌细胞外，常常聚集形成多酶复合体。真菌能产生大量的纤维素酶，产生的酶组分全能分泌到菌体外，一般不聚集成多酶复合体，但可以相互发生强烈的协同作用[6]。

1.2  马克斯克鲁维酵母的概述文献综述

马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）是一类非传统的酵母。近年来，由于具有耐高温、可利用底物广泛、蛋白分泌能力强、生长速率快等优势以及在纤维素乙醇生产中的良好应用前景而受到人们的关注[7, 8]。马克斯克鲁维酵母可以在30℃- 45℃温度下利用多种纤维素原料进行乙醇发酵，包括各种农产品副产物与废弃物，如稻杆、麦杆、水果榨汁后的残渣等，以及一些能源草类植物，如柳枝稷、狼尾草等[8]。

2  材料与方法

2.1  材料

2.1.1  菌株与质粒

研究所用的质粒pMV-EG2为本实验室保留。感受态由大肠杆菌DH5a由淮阴师范学院生命科学学院保存；表达载体pKLACl、马克斯克鲁维酵母购自纽英伦生物技术（北京）有限公司。

2.1.2  实验主要试剂

限制性内切酶KpnI、NotI、ScaII和T4 DNA Ligase购自纽英伦生物技术（北京）有限公司