1  材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株

  pET28a-GASBD2质粒、质粒pBIN19/SBD2和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105 (具有利福平抗性)为本实验室保存。

1.1.2 酶与试剂

头孢霉素(Cefotaxime, Cefo);利福平(Rifampicin, Rif);NcoI酶;BamHI酶;CTAB 抽提液(1.4M NaCl,2% CTAB, 20 mM EDTA,100 mM Tris-HCl);β-巯基乙醇;氯仿(异戊醇(24:1)混合液);异丙醇;Taq酶

1.1.3 植物材料

马铃薯栽培品种Desiree的无菌苗

1.1.4  培养基

LB 培养基:蛋白胨10 g/L,酵母提取物 5 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.2。

预培养基(M1):MS (Murashige-Skoog)培养基 + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA;共培养

基(M2):MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA + 100μM AS;诱导培养基(M3):MS + 0.1mg/L 2,4-D + 1mg/L 6-BA +250mg/L Cefo+ 50mg/L Kan;芽分化培养基(M4):MS + 1mg/L GA3 + 1mg/L ZT +250mg/L Cefo +50mg/L Kan;生根培养基(M5):MS +250mg/L Cefo + 50mg/L Kan。文献综述

1.2 方法

1.2.1 植物表达载体pBIN19/GASBD2的构建

在本实验中,植物表达载体pBIN19/GASBD2用于GASBD2重组蛋白在马铃薯块茎中特异性表达。

以pBIN19/SBD2质粒[2]为基础构建植物表达载体pBIN19/GASBD2。pBIN19/SBD2质粒含有GBSSI转运肽序列和GBSSI启动子以及烟脂碱合成酶基因的终止子序列(见图1)。质粒构建的具体操作如下:用pET28a-GASBD2质粒DNA作为模板,用一对相同的引物进行NcoI-GASBD2-BamHI 基因片段的扩增。上游引物序列为:5′-TATTAGCCCATGGATTGCACCACTCCCACCGC-3′;下游引物序列为:5′-TATATAGCCGGATCCGCGCCAGGTGTCAGT-3′,其中划线的部分为NcoI和BamHI的酶切位点。用NcoI和BamHI双酶切纯化的NcoI-GASBD2-BamHI的PCR扩增片段,在pBIN19/SBD2质粒DNA的相应酶切位点中插入回收的NcoI-GASBD2-BamHI 片段,即得到植物表达载体pBIN19/GASBD2。然后提取pBIN19/GASBD2质粒DNA进行PCR 扩增检测,对PCR检测结果为阳性的质粒进行双酶切鉴定。

 pBIN19/SBD2质粒的结构示意图

图 1 pBIN19/SBD2质粒的结构示意图

Fig 1 Schematic representation of pBIN19/SBD2 plasmids.

1.2.2  农杆菌的转化及鉴定

    取两管农杆菌EHA105感受态细胞,冰上解冻,加入pBIN19/GASBD2质粒5μL混匀,先将样品放入进行预冷过的0.2cm 宽的电极杯中,电压2.2kV,电容25μF,电阻200 Ω,电击5 ms。取出电极杯,加入LB液体培养基800μL,转移至1.5mL离心管中。在28℃,150 r/ min的条件下振荡培养4h,然后在含有卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)的LB平板上涂布,在28℃的条件下培养2-3d。提取质粒后,用一对引物5′-CGACGGCATAGCTCTGA GTGC-3′和5′-CGGATAAACTTGTACTCAAAC-3′对pBIN19/GASBD2质粒进行PCR鉴定。

1.2.3  马铃薯的遗传转化

采用优化后的遗传转化体系将马铃薯栽培品种Desiree无菌苗进行转化。先剪取长度约为1cm的马铃薯茎段,放于预培养基上,在23±1℃、16 h的光照条件下进行预培养2d。然后用OD600为0.6的农杆菌菌液侵染马铃薯茎段10 min,将茎段转移到共培养基上,在28℃、无光照的条件下进行共培养2d。共培养结束后,再将马铃薯茎段转移到含有250 mg/ L头孢霉素的愈伤诱导培养基上,在23±1℃、16 h的光照条件下进行培养,每隔10 d 就换1次新鲜培养基。约4周后将抗性愈伤组织转移到分化培养基上进行诱导分化。当抗性芽长到2-3 cm时,将其剪下并转接到生根培养基上,在23±1℃、16 h的光照条件下进行生根培养[3-4]。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

1.2.4  转化植株的PCR检测

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