根据生物药物的性质和特点常用的定量分析方法包括酶法、电泳法、免疫分析法、理化测定法、生物检定法。本课题采用理化测定法中的HPLC法对555定量分析方法进行验证。HPLC是在经典气相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法,近几年随着计算机技术的发展,逐步实现了HPLC和各种检测仪器的联用,使其应用范围得到了极大的拓展[10]。并且由于其具有分离效率高、灵敏度好、选择性强、含量测定准确等优点,现已广泛的应用在药品检验工作中,更为本课题的研究提供了准确的数据来源。

2 材料和方法

2.1 仪器和试剂

表2-1 实验仪器

仪器 制造商

高效液相色谱仪LC-20A 日本岛津公司

电子分析天平XS105 梅特勒-托利多集团

电子分析天平AL204 梅特勒-托利多集团

低温光照仪LS-3000uv 上海君翼仪器公司

移液枪 德国艾本德公司

超声波清洗机 浙江法兰特超声波科技有限公司

表2-2 实验试剂

试剂 制造商

555样品 江苏万邦生化医药股份有限公司(自制)

555对照品 中国药品生物制品检定所

乙  腈(色谱纯) 美国默克公司

磷  酸(分析纯) 中国医药集团

氯 化 钠(分析纯) 中国医药集团

氢氧化钠(分析纯) 中国医药集团

30%过氧化氢(分析纯) 中国医药集团

二水合磷酸二氢钠(分析纯) 中国医药集团

2.2 溶液配制

0.01mol/L盐酸(1L):精密吸取12mol/L的盐酸溶液0.83ml溶于999.17ml的双蒸水中,摇匀即得。

9.6mol/L盐酸(10ml):精密吸取12mol/L的盐酸8ml溶于2ml的双蒸水中,摇匀即得。

1mol/L盐酸(10ml):精密吸取12mol/L的盐酸0.83ml溶于9.17ml的双蒸水中,摇匀即得。来!自~优尔论-文|网www.youerw.com

10mol/L氢氧化钠(10ml):精密称取氢氧化钠固体4g溶于10ml的双蒸水中,摇匀即得。

1mol/L氢氧化钠(10ml):精密吸取10mol/L的氢氧化钠溶液1ml溶于9ml双蒸水中,摇匀即得。

磷酸盐缓冲液(1L):精密称取磷酸二氢钠20.7g,加水800ml溶解,再用85%磷酸调节pH至2.5,加水至1000ml,滤过即得。

流动相A(1L):精密称取氯化钠18.4g,加磷酸盐缓冲液250ml溶解,加乙腈250ml,混匀后,用水稀释至1000ml,滤过作为流动相A。

流动相B(1L):精密称取氯化钠3.2g,加磷酸盐缓冲液250ml溶解,加乙腈650ml,混匀后,用水稀释至1000ml,滤过作为流动相B。

2.3 定量分析方法的建立

   本课题采用高效液相色谱法,所使用的色谱柱型号为Inertsil ODS-SP,250mm×4.6mm,5μm,GL Science Inc,色谱柱柱温设定至35℃。检测波长设定为214nm,检测流速为1.0ml/min。进样器温度为5℃,每次进样20μl,洗针液采用50%甲醇水溶液,运行时间为40min,流动相比例见表2-3。

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