摘要：大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌，是一种寄居在人和温和动物大肠内的正常菌群，一般多不致病，是一种普遍存在的原核生物，属于革兰氏阴性短杆菌，主要存在于大肠中[1]。大肠杆菌的研究从未停止过，对大肠杆菌各段基因的协同作用机理仍在研究中，本实验致力于构建大肠杆菌基因缺失株，采用较为高效的重叠延伸PCR技术，对大肠杆菌中ssrA基因和smpB基因分别作基因敲除[2]。为后续研究大肠杆菌ssrA基因缺失对大肠杆菌蛋白表达的影响做前期准备，同时与smpB基因缺失株的对比，分析两种基因分别缺失对大肠杆菌的影响。71289

毕业论文关键词：基因敲除，重叠延伸PCR，大肠杆菌

Abstract：Escherichia coli (E.coli) is one of the Escherichia genus bacteria, it is a hermit and gentle animal intestine in normal flora, general pathogenic prokaryote belonging to the gram negative bacillus, mainly deposits in the large intestine. Study on Escherichia coli never stopped, the mechanism of pathogenic Escherichia coli is still in the study. In order to study the effect of E.coli ssrA gene deletion on the protein expression, our study mainly built the Escherichia coli ssrA gene and smpB gene deletion strains, using more efficient overlap extension PCR.

Key Word：Escherichia coli, gene knockout, overlap extension PCR 

目录

1 材料 4

1.1 菌株和质粒 4

1.2 主要试剂 4

1.3 需配制的试剂 4

1.4 使用仪器 5

1.5 PCR相关材料 5

2 实验步骤 6

2.1 复苏及扩增大肠杆菌 6

2.2 大肠杆菌DNA模板的制备 6

2.3 获得ssrA1，ssrA2，smpB1，smpB2，ssrA-PKD3，smpB-PKD3片段 6

2.4 在PrimeStar酶作用下连接三段产物 7

2.5 扩增连接产物 8

2.6 电转化感受态细胞的制备及转化 9

2.6.1 电转化感受态细胞的制备 9

2.6.2 电转化构建突变株 9

3 实验结果 10

3.1 菌种复苏结果 10

3.2 基因扩增及纯化 10

3.2.1 ssrA1，ssrA2，smpB1，smpB2基因扩增结果 10

3.2.2 ssrA1，ssrA2，smpB1，smpB2四段基因的纯化结果 11

3.2.3 ssrA-PKD3，smpB-PKD3基因扩增结果 11

3.2.4 ssrA-PKD3，smpB-PKD3基因的纯化结果 11

3.3 三段基因连接示意图 12

3.4 将连接产物导入感受态细胞 13

3.5 保存菌种为后续实验做准备 14

结论 15

讨论 15

参考文献 16

致  谢 17

1 材料

1.1 菌株和质粒

本实验使用的菌株E058是由本实验室保存的大肠杆菌的野生菌株，大肠杆菌突变株E058ΔssrA，E058ΔsmpB均由本实验室构建和保存。