电泳仪 北京市六一仪器厂 DYY-6C

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小型离心机 eppendorf Centrifuge 5418

台式高速冷冻离心机 eppendorf Centrifuge 5810R

电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司 DKZ-1

电磁炉 尚朋堂 SR1603-A

超低温冰箱 Haier（海尔） L286

1.5 PCR相关材料

本实验使用的引物由赛百盛公司合成，引物合成相关序列如下。

表5 引物合成单

Name Sequence（5'> <3'）

ssrA1-F GGC TGA TTC TGG ATT CGA CGG

ssrA1-R GTT ATT AAG CTG CTA AAG CGT AG

ssrA2-F GAA GCG TTA AAA CTT AAT CAG GCT AG

ssrA2-R GTG GAG CTG GCG GGA GTT GAA CC

ssrA-PKD3-F CTA CGC TTT AGC AGC TTA ATA ACG CAG CAT TAC ACG TCT TGA GCG

ssrA-PKD3-R CTA GCC TGA TTA AGT TTT AAC GCT TCG ACA CAG GAA CAC TTA ACG GCT G

smpB1-F GAC GAA GAA AAA AGC AGA TAA ACC

smpB1-R CGT AGC TGT CGC TGA TAT TGG

smpB2-F GCG TCA ATC GAG AAG GCT ATA C

smpB2-R GAT ACG TGC TTT ATC CAC CTG C

smpB-PKD3-F CCA ATA TCA GCG ACA GCT ACG GCA GCA TTA CAC GTC TTG AGC G

smpB-PKD3-R GTA TAG CCT TCT CGA TTG ACG CGA CAC AGG AAC ACT TAA CGG CTG

表6 PCR试剂说明

PCR试剂名称 来源

10×Taq酶反应缓冲液 北京佳兰

dNTPs 10mM 北京佳兰

Taq酶 5U 北京佳兰来,自|优;尔`论^文/网www.youerw.com

2×Pfu PCR Mix 北京佳兰

表7 其他说明

名称 用途 来源

AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 凝胶回收试剂盒 AXYGEN

2 实验步骤

2.1 复苏及扩增大肠杆菌

按照表3试剂比例配制新鲜的LB固体培养基[3]，在无菌操作台中，将保存于本实验室-70℃的野生大肠杆菌E058样本用接种环蘸取菌液，涂布在不含任何抗生素的LB固体培养基上，全温度恒温培养箱中37℃过夜培养[4]。

第二天，在无菌操作台中操作，取1mL的LB液体培养基至1.5mL离心管中[5]，挑选单菌落放入离心管中，置于37℃，转速200rpm摇床中，过夜培养至培养基浑浊[6]。获得大量扩增的大肠杆菌E058菌液。