摘要肌红蛋白（myoglobin，Mb）广泛存在于脊椎动物的心脏肌和骨骼肌中，是一种肌肉 组织中的特殊蛋白质，主要功能是存储氧并且能够为细胞连续提供氧。通过定点突变技 术构建 S92A/A94C/Y146S 变异型的肌球蛋白质粒，使其能在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功 表达。将细胞破碎后的蛋白粗提物离心后，将上清进行 65%硫沉、离心后上清进行 95% 硫沉，再次离心后取沉淀溶于缓冲液中透析、然后用 DEAE-sefinose 阴离子交换层析以及 sephadex G-75 凝胶层析进行了分离纯化，期间采用 SDS-PAGE 电泳和紫外可见分光光度 计来监测蛋白的纯度。纯化后的 Mb S92A/S94C/Y146S 点突变蛋白与氮氧化物反应研究 利用分子光谱来实现。最后采用坐滴及悬滴蒸汽扩散法对纯化的突变蛋白进行直接结晶， 得到了细小的针状晶体。73302

毕业论文关键词 肌红蛋白 离子交换层析 凝胶层析 分子光谱 结晶条件筛选

毕 业 设 计 说 明 书 外 文 摘 要

Title Structure and Function Studies of Myoglobin S92A/A94C/Y146S mutant

Abstract Myoglobin (Mb) is widely present in all vertebrate cardiac and skeletal muscles。 This muscle protein plays a crucial role in oxygen storage in the respiratory system。 By using site-directed mutagenesis method, the vector of Mb S92A / A94C / Y146S mutant was prepared, and the protein was expressed successfully in E。coli BL21(DE3)。 After the cells were  lyzed  and followed by centrifuge, the Mb ACS mutant protein was isolated and purified through ammonium sulfate precipitation, dialysis, DEAE-anion exchange chromatography and gel filtration chromatography。 SDS-PAGE electrophoresis and UV-vis spectroscopy were used to monitor the protein through the purification steps。 The reactions of the purified Mb ACS mutant with nitrogen oxides were measured by UV-vis spectroscopy。 Finally, crystallization of Mb ACS mutant was carried out by using hanging-drop and sitting-drop vapor diffusion methods which lead to the formation of tiny needle crystals。

Keywords Myoglobin Ion Exchange Chromatography(IEC) Gel Filtration Chromatography Molecular Spectroscopy Protein Crystallization

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目 次

1 绪论 1

1。1 肌红蛋白的结构与功能 1

1。2 蛋白质的分离纯化方法 2

1。3 蛋白质与小分子的相互作用 3

2 Mb ACS 的表达、分离及提纯 5

2。1 实验仪器和材料 5

2。 1 。 1 实验仪器及设备 5

2。 1 。 2 实验耗材及试剂 6

2。 1 。 3  试剂的配制 7

2 。 2 实 验 方 法 9

2 。 2 。 1  Mb AC S 的 制 备 9

2 。 2 。 2  Mb AC S 的 分 离 与 提 纯