图 1。2 肌红蛋白与血红蛋白β亚基的结构比较

肌红蛋白算是目前了解得比较清楚的一种肌肉中的蛋白了。对于哺乳动物来说，肌红蛋 白具有存储蛋白、存储氧并且连续提供氧的功能，当机体缺氧时肌红蛋白可以作为肌质细胞 氧的存储地从而维持其机械功能[4]。当供氧不足时，肌红蛋白可通过促进氧的弥散来提高外 周氧[5]。肌红蛋白还可以通过氧化磷酸化促进 ATP 的合成，调节心肌细胞的 NO 生物利用度。 氧化磷酸化的重要调节器就是 NO。NO 与氧竞争结合且抑制细胞色素 C，来进一步抑制线粒 体呼吸[6]。因此，肌红蛋白还可以预防肌肉呼吸抑制。另据报道，肌红蛋白还具有过氧化物 酶的活性。

1。2 蛋白质的分离纯化方法

研究蛋白质的性质，就需要纯的蛋白质样品，这就需要更加可靠、高效的蛋白质分离纯 化方法。目前提取纯化大量蛋白质的方法主要有沉淀法、透析、离子交换层析以及凝胶过滤 层析等。下面对本课题采用的几种蛋白质分离纯化的方法进行简单介绍：

（1）硫铵分级沉淀

硫酸铵是常用的沉淀蛋白质的盐，由于冷的缓冲液可以保护蛋白活性，因此本课题采

本科毕业设计说明书 第 3 页 用硫酸铵沉淀法做纯化的第一步。水溶液中蛋白质的溶解度是由周围的亲水基团与水形成水 化膜的程度及蛋白质分子带电荷的情况决定的[7]。本课题采用浓度为 65%的硫铵去除一些杂

蛋白以及非蛋白成分。然后采用浓度为 95%的硫铵沉淀出肌红蛋白。而且蛋白在硫铵沉淀中 比较稳定，这种状态下可以长期保存中间产物。

（2）透析和超过滤

透析利用了蛋白质分子不能通过低分子量分子膜的性质，将蛋白质和其他小分子物质 分开。超过滤是利用离心力或压力，强行使其他小分子溶质和水通过一定分子尺寸（常用 10KDa）的分子膜，但是蛋白质被截留在膜上，从而达到脱盐和浓缩的目的。

（3）离子交换层析

离子交换层析是目前使用最广的层析技术之一。由于蛋白质大都同时带有正负两种电 荷，离子交换层析就是利用蛋白质与带电的介质之间的可逆吸附或者蛋白质之间所带静电荷 的差异来达到分离目的，可以通过改变溶液中的盐离子强度和 pH 来完成蛋白质混合物的分 离。本课题中肌红蛋白的等电点为 7。07，因此选用在缓冲液 pH 为 8。5 的条件下使用 DEAE 阴离子交换柱进行洗脱。

（4）凝胶过滤层析来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

凝胶过滤层析是一种常用的蛋白质分离方法，又称为凝胶渗透层析、分子筛层析、凝 胶排阻层析、凝胶过滤等。当混合物跟随流动相经过装有凝胶的层析柱时，混合物中的各物 质因分子大小不同而被分离。因此从广义上说凝胶是一类具有多孔网状的三维空间物质。肌 红蛋白的分子量大约为 17000，而 Sephadex G-75 葡聚糖凝胶 G-75 分离范围 3000-80000 因 此本课题选用 sephadex G-75 对肌红蛋白进行纯化分离。

1。3 肌红蛋白与氮氧小分子的相互作用

已有研究证明血红蛋白作为高等动物体内氧输送蛋白在调控氮氧化物也起着不可或缺的 作用[8]。由于血红蛋白结构较为复杂，而肌红蛋白相比较于血红蛋白结构较为简单，通过比 较两者结构，将肌红蛋白相关位点的氨基酸突变为与血红蛋白 beta 链氨基酸残基，如本课题 的 S92A/A94C/Y146S。通过研究该三点突变蛋白的结构以及其与氮氧化物的相互作用，为血 红蛋白－氮氧化物结构功能学提供必要的结构支持。肌红蛋白可通过可逆地与一氧化碳和一 氧化氮等小分子配体结合与释放来调节其他血红素蛋白的生理功能，因此，肌红蛋白又被称 为“生物学中的氢原子”[8]，一直被科学家们当作一个模型体系来研究蛋白质的结构与功能关 系。许多最新的研究证明，肌红蛋白能够结合可能对细胞功能有利或有害影响的 NO 分子[9]。 Brunori 认为，肌红蛋白通过与 NO 结合减少机体内 NO 的量，因此可被视为心肌和氧化骨骼肌中的一个重要的 NO 清道夫[10]。随后，Flöge 等人的一篇论文提供了有说服力的实验证据支 持了这一说法[6]。在肌红蛋白缺陷型小鼠的骨骼肌和心肌功能中 NO 的相关变化也为这一说 法提供了证据。