MicroRNAs (miRNAs)是广泛存在于真核生物中的一种内源性的单链的小分子RNA，长度在21~24 nt。miRNA在细胞核内由酶剪切成带有茎环结构的前体miRNA (Lee等2003)，前体miRNA被转运到核外之后，再由酶剪切形成成熟miRNA (Hutvagner等2001)。miRNA在植物体内对靶基因的作用方式主要有剪切和抑制翻译两种，这两种方式的选择主要取决于miRNA与其靶mRNA序列互补的程度，若二者近乎完全互补，则剪切mRNA；若不完全互补，则抑制其翻译(Tang等2003; Zhang等2006)。2002年Carrington研究小组在拟南芥中首次克隆出miRNA（Llave et al。, 2002），之后又相继发现这类RNA虽然不能编码蛋白质，但在植物的发育及逆境响应等多种生理活动中发挥着重要调节作用。研究人员采用多种生物学方法，发现miRNA参与植物逆境胁迫反应（Yang等2011;刘生财等2012;马圣运等2012;范鹏珍等2012;王海波等2013）。

研究人员通过miRNA芯片和高通量测序的方法鉴定出了许多缺磷响应的miRNA，包括一些保守的miRNA（如miR156、miR169、miR391、miR395、miR398、miR447、miR827和miR866等）和非保守的miRNA（如miR778、miR1507和miR2111等）（Pant et al。, 2009; Hsieh et al。, 2009; Lundmark et al。, 2010）。但目前，只对于miR399和miR827调节植物磷素平衡的研究有些进展。在缺磷条件下，拟南芥miR399被大量诱导表达，抑制了其靶基因PHO2的表达，而PHO2又负向调控于高亲和性磷酸盐转运蛋白的产生，因此过量表达miR399会导致植物过量积累磷酸盐（Fujii et al。, 2005; Bari et al。, 2006; Chiou et al。, 2006; Valdés-López et al。, 2008; Chiou, 2007; Zeng et al。, 2014）。通过研究还发现miR827通过调控靶基因SPX-MFS蛋白，在维持磷的稳态平衡中也发挥重要作用（Lin et al。, 2010; Kant et al。, 2011）。其他缺磷响应miRNA是怎样参与植物缺磷胁迫反应以及在植物磷素营养平衡中的作用还不明确。文献综述

研究表明miR408的成熟片段受缺磷胁迫强烈诱导表达（Pant等2009）。miR408家族在拟南芥基因组中只有一个成员，其靶基因有至少有4个：LAC3 (At2g30210); LAC12 (At5g05390); LAC13 (AT5G07130); Plantacyanin (AT2G02850)，它们大多参与植物缺铜反应和植物的生长发育(Abdel-Ghany and Pilon 2008; Zhang et al。 2014)。然而受缺磷诱导表达的miR408是否在植物缺磷反应中发挥作用，以及植物缺铜和缺磷反应之间是否存在联系目前还不明确。

2。 材料与方法2。1 实验材料

野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）（wild-type, WT）；miR408过表达转基因株系miR408-OX-3，,miR408-OX-4，miR408-OX-12。

2。2 主要仪器

    超净工作台、电子天平、低温冰箱、培养盆、离心机、分光光度计、研钵、烘箱水浴锅 

2。3拟南芥培养

取一定量的拟南芥种子（野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）（wild-type, WT），miR408过表达转基因株系miR408-OX-3，,miR408-OX-4，miR408-OX-9，miR408-OX-11，miR408-OX-12）于培养基上进行培养，应先进行灭菌再点种，步骤如下：来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

（1）用1/3 bleach溶液清洗10 分钟。

（2）再用无菌的去离子水清洗3-4遍，清洗掉一些不饱满的种子和杂质以及剩余的bleach。

（3）用0。1%的琼脂糖溶液使种子分散悬浮于移液枪枪头（1ml）中，然后用枪头将种子点在配制好的1/2 MS培养基上（含有1%琼脂粉和1%的蔗糖，PH调至5。7）。

（4）在4℃冰箱避光保存48小时后，将培养皿放入光照培养箱中培养，7天后将植物移入土中培养。土培按照蛭石、营养土 1:3配制实验用土。

    在用1/2 MS培养基培养拟南芥测定根长和生物量的的缺磷实验中，需要在4天后，将拟南芥移入缺磷的培养基上进行培养，缺磷营养基营养液配方见表1。培养7天后，统计供磷和缺磷条件下，拟南芥幼苗的根长和生物量。