小麦根际解钾细菌的分离筛选及鉴定(3)
（4）挑取具有较明显透明圈的单菌落纯化多次，直至通过平板观察和镜检确定其为纯培养物后，挑取单菌落转接到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，分别注明采样地及菌株编号，然后置于4 ℃冰箱保存。
1.2.2 解钾菌的复筛
（1）挑选初筛得到的各解钾菌的单菌落，接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化。
（2）将活化的菌株分别接种到1号筛选培养基上，进行扩大培养中。28 ℃恒温倒置培养4 d。无菌条件下，用无菌水洗涤平板，制菌悬液。
（3）参照文献[17]的方法，测定初筛菌的解钾活性。取100 mL解钾活性培养基于250 mL锥形瓶中，每瓶接人5 mL菌悬液(活菌数约为108 cfu/mL)，对照组加入等量无菌水，每组设3个重复，28 ℃，160 r/min摇床培养7d。取培养液，1000 r/min离心10 min，去粗渣后再做两种处理。处理Ⅰ：取10 mL培养液，8000 r/min离心10 min，取上清液；处理Ⅱ：取10 mL培养液，加6％H202消煮1 h，采用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎5 min，5000 r/min离心15 min，取上清液,用原子吸收法[18]测定速效钾含量记录其读数，通过标准曲线求得钾浓度。与对照组进行比较，得出不同菌株解钾效率。
解钾率（％）=[实验组速效钾含量（mg/L）－对照组速效钾含量（mg/L）]×100 mL/[钾长石粉量（g）×全钾含量(％)]×100％。
1.2.3 菌体特征观察
挑取在牛肉膏蛋白胨培养基上活化后的各菌株，接种到1号筛选培养基平板上，28 ℃恒温培养后进行细菌单染色、革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色，在显微镜下观察其菌体形态，具体染色方法参照文献[19]。
1.2.4 菌落形态观察
挑取在牛肉膏蛋白胨培养基上活化后各菌株穿刺接种到1号筛选培养基上，28 ℃恒温培养，观察其生长状况及菌落特征[19-21]，包括菌落颜色、润泽与否、菌落形状、菌落隆起还是平整、边缘圆整还是有缺刻、表面光滑与否、是否透明、是否容易挑起等。
1.2.5 生理生化鉴定
以1号筛选培养基为基础培养基，参照常用细菌系统鉴定手册[20]，对解钾能力较强的K1、K3和K7进行生理生化鉴定。包括以下实验：氧化酶、葡萄糖发酵试验、淀粉酶试验、V-P测定、接触酶反应、柠檬酸盐利用试验、吲哚试验、明胶液化试验和M.R试验等。
1.2.6 盆栽实验
挑选籽粒饱满、无残缺的小麦种子（周麦22），用体积分数为75％的酒精表面消毒30 s，蒸馏水洗涤3-4遍，放置于25 ℃恒温培养箱中浸种24 h。然后置于有灭菌的湿纱布的培养皿上。室温下催芽，催芽过程中保持培养皿湿润。待小麦种子整齐发芽后，播种于300 mm×200 mm×50 mm的托盘中，所用的土是经两次高压湿气灭菌的有机质极为丰富的菜园土，每托盘播种50颗小麦种子，每组设置3个重复。然后将托盘置于温室中，室温(28 ℃)下培养。空白组用不含速效钾的Hogland培养液和钾长石粉处理；对照组用Hogland培养液和钾长石粉处理；实验组用不含速效钾的Hogland培养液、钾长石粉和活菌数约为108 cfu/mL的菌悬液处理。每天定时补充两次营养液，每次30 mL：菌悬液每3 d施加一次，每次2 mL。3 d后观察出苗率。出苗20 d后取材，比较植株根长、根重、株高、鲜重。最后，试验数据使用SPSS 16.0统计软件对数据进行单因素方差统计分析[22]。
Hogland营养液，其配方如下:
四水硝酸钙945 mg/L，硝酸钾506 mg/L，硝酸铵80 mg/L，磷酸二氢钾136mg/L，硫酸镁 493mg/L，铁盐2.5 mL，微量元素液5 mL，pH=6.0
铁盐溶液：七水硫酸亚铁2.78 g，乙二胺四乙酸二钠3.73 g，蒸馏水500 mL，pH=5.5
微量元素液：碘化钾0.83 mg/L，硼酸6.2 mg/L，硫酸锰22.3 mg/L，硫酸锌8.6 mg/L，钼酸钠0.25 mg/L，硫酸铜0.025 mg/L，氯化钴0.025 mg/L