(4)挑取具有较明显透明圈的单菌落纯化多次,直至通过平板观察和镜检确定其为纯培养物后,挑取单菌落转接到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上,分别注明采样地及菌株编号,然后置于4 ℃冰箱保存。
1.2.2 解钾菌的复筛
(1)挑选初筛得到的各解钾菌的单菌落,接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中活化。
(2)将活化的菌株分别接种到1号筛选培养基上,进行扩大培养中。28 ℃恒温倒置培养4 d。无菌条件下,用无菌水洗涤平板,制菌悬液。
(3)参照文献[17]的方法,测定初筛菌的解钾活性。取100 mL解钾活性培养基于250 mL锥形瓶中,每瓶接人5 mL菌悬液(活菌数约为108 cfu/mL),对照组加入等量无菌水,每组设3个重复,28 ℃,160 r/min摇床培养7d。取培养液,1000 r/min离心10 min,去粗渣后再做两种处理。处理Ⅰ:取10 mL培养液,8000 r/min离心10 min,取上清液;处理Ⅱ:取10 mL培养液,加6%H202消煮1 h,采用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎5 min,5000 r/min离心15 min,取上清液,用原子吸收法[18]测定速效钾含量记录其读数,通过标准曲线求得钾浓度。与对照组进行比较,得出不同菌株解钾效率。
解钾率(%)=[实验组速效钾含量(mg/L)-对照组速效钾含量(mg/L)]×100 mL/[钾长石粉量(g)×全钾含量(%)]×100%。
1.2.3 菌体特征观察
挑取在牛肉膏蛋白胨培养基上活化后的各菌株,接种到1号筛选培养基平板上,28 ℃恒温培养后进行细菌单染色、革兰氏染色、芽孢染色、荚膜染色,在显微镜下观察其菌体形态,具体染色方法参照文献[19]。
1.2.4 菌落形态观察
挑取在牛肉膏蛋白胨培养基上活化后各菌株穿刺接种到1号筛选培养基上,28 ℃恒温培养,观察其生长状况及菌落特征[19-21],包括菌落颜色、润泽与否、菌落形状、菌落隆起还是平整、边缘圆整还是有缺刻、表面光滑与否、是否透明、是否容易挑起等。
1.2.5 生理生化鉴定
    以1号筛选培养基为基础培养基,参照常用细菌系统鉴定手册[20],对解钾能力较强的K1、K3和K7进行生理生化鉴定。包括以下实验:氧化酶、葡萄糖发酵试验、淀粉酶试验、V-P测定、接触酶反应、柠檬酸盐利用试验、吲哚试验、明胶液化试验和M.R试验等。
1.2.6 盆栽实验
挑选籽粒饱满、无残缺的小麦种子(周麦22),用体积分数为75%的酒精表面消毒30 s,蒸馏水洗涤3-4遍,放置于25 ℃恒温培养箱中浸种24 h。然后置于有灭菌的湿纱布的培养皿上。室温下催芽,催芽过程中保持培养皿湿润。待小麦种子整齐发芽后,播种于300 mm×200 mm×50 mm的托盘中,所用的土是经两次高压湿气灭菌的有机质极为丰富的菜园土,每托盘播种50颗小麦种子,每组设置3个重复。然后将托盘置于温室中,室温(28 ℃)下培养。空白组用不含速效钾的Hogland培养液和钾长石粉处理;对照组用Hogland培养液和钾长石粉处理;实验组用不含速效钾的Hogland培养液、钾长石粉和活菌数约为108 cfu/mL的菌悬液处理。每天定时补充两次营养液,每次30 mL:菌悬液每3 d施加一次,每次2 mL。3 d后观察出苗率。出苗20 d后取材,比较植株根长、根重、株高、鲜重。最后,试验数据使用SPSS 16.0统计软件对数据进行单因素方差统计分析[22]。
Hogland营养液,其配方如下:
四水硝酸钙945 mg/L,硝酸钾506 mg/L,硝酸铵80 mg/L,磷酸二氢钾136mg/L,硫酸镁 493mg/L,铁盐2.5 mL,微量元素液5 mL,pH=6.0
铁盐溶液:七水硫酸亚铁2.78 g,乙二胺四乙酸二钠3.73 g,蒸馏水500 mL,pH=5.5
微量元素液:碘化钾0.83 mg/L,硼酸6.2 mg/L,硫酸锰22.3 mg/L,硫酸锌8.6 mg/L,钼酸钠0.25 mg/L,硫酸铜0.025 mg/L,氯化钴0.025 mg/L
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