白质和下层有机相。（离心后样品管内液体被分为三层，上层水相上清液，中层蛋白质层， 下层有机相）。

7) 第二次加入与上清液等体积平衡酚，重复步骤 4-6。

8) 向离心管中加入与上清液等体积的酚和氯仿 （酚：氯仿=1:1）：上清液体积=1:1，重复步 骤 5-6。

9) 重复步骤 8，直至两相界面看不到蛋白质层。文献综述

10) 向离心管中加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合物（氯仿：异戊醇=24:1），重复步 骤 5-6。

11) 向离心管中加入 2 倍抽提物体积的-20℃预冷无水乙醇，立即上下翻转混合至絮状 DNA 出 现。

12) 将酒精沉淀 DNA 10000rpm 离心 10min（4℃），缓慢倒掉酒精，或用移液枪枪尖将絮状 DNA 挑出来放入新的无菌离心管中。 向离心管中加入 300uL 70%乙醇洗涤 DNA 沉淀，缓 慢倒掉 70%乙醇，再重复洗涤一次。

13) 倒掉酒精后的离心管倒置或平放在纸巾上使其在室温下空气干燥至酒精完全挥发，根据

DNA 沉淀量加入 200-400ulL TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀。

14) 将待溶解 DNA 沉淀置于摇床缓慢摇动 24 小时，促进 DNA 溶解。

15)  DNA 原液-20℃保存备用。

2。4PCR 扩增筛选多态性引物2。4。1 PCR 扩增体系表 1 PCR 反应体系

成分组成（component） 体积 volume（μl）

ddH2ODNTPloding Buffer Taq 酶

引物 模板 10

反应体系如下:1μL DNA，0。4μL 引物（10μL 正向引物，10μL 反向引物，180μL ddH2O 配 制而成），1。25μL 10×buffer，0。4μL dNTP，0。1μL TaqDNA 聚合酶(5U/μL)，加超纯水 10μL。

PCR 扩增条件为 95℃，4min；95℃，35s，46℃，35s；72℃，46s。36 个循环；72℃，5min； 25℃，2min。

2。4。2 PAGE 胶的配制及电泳分析来*自~优|尔^论:文+网www.youerw.com +QQ752018766*

表 2 PAGE 胶配比

SDS 胶成分 体积

30%Acr 溶液 10ml

5X TBE 7。5ml

H2O 13ml

AP 溶液 180ul

TEMED 溶液 20ul

玻璃板的预处理：将玻璃板用清水清洗干净并晾干。在灌胶前，用洁净柔软的纸巾按照 从上到下的顺序将玻璃板擦拭干净。固定好两块玻璃板，并使其水平放置。

配胶：按照聚丙烯酰胺胶的配比配制胶（按顺序逐一添加，并混匀），灌满后小心地将 梳子插入胶中，并在室温下放置 1-2h 使胶凝固。

PAGE 电泳：电泳时恒压，电压为 230V，取上样液 3ul 上样，Super DNA marker(康为世 纪出品)4ul。电泳 2h40min。

PAGE 胶染色、显色：电泳结束后，用小刀轻轻地将两块板分开，胶应留在长玻璃板上。 将跑胶好的胶放置于 EB 溶液中染色近 10min 后取出，经紫外成像仪拍照，统计基因型。