5) 每个样品选取10株，要选取大小近似的样品，关灯两天培育；

6)  等植株长有4片以上的叶子前，每三天浇一次水，等植株长有4片以上的叶子后，每天需要浇水，等植株长有6片以上的叶子时，准备接种

3。2 转基因的本氏烟草的接种

1) 每个样品选取生长状况良好大小一致的样品各选取6株，并做好标签；

2) 在每个要接种的植物叶片上，均匀的撒上适量的石英砂；

3) 在接种叶片上接种约10 l的ACMV病毒溶液；

4) 用手指轻轻从里到外摩擦，使溶液沾满了叶片的整个表面，用喷雾器在植物上方洒上适量的水；

3。3观察转基因的本氏烟草的现象

     每天观察本氏烟草并且要记录发病的时间，发病的症状，发病的株数等。

3。4 采样

     收集各样品株系上的新鲜染病叶片并标记。

3。5 本氏烟草基因组的提取

     本实验用TPS方法来提取基因组，在将全部的基因组进行浓度的测定，最终将所有的基因组浓度稀释到所有离心的步骤均要在4 ℃下进行，其他步骤也全部要在冰上操作。具体步骤详见1。2。1。

3。6 PCR检测染病株系中的DNA分子来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

    使用康维公司的2xTaq-MasterMix kit。提取的基因组先用内参引物来查看提取的基因组中病毒的DNA的存在情况。PCR体系及条件详见1。2。5。

 3。7 最佳引物的筛选

分别用1号ACMV-Pro-F×ACMV-ORI -R引物对

2号ACMV-Pro-F×ACMV_PRO-Xhol-R引物对

3号ACMV-AV1pro-F×ACMV-AV1pro -R引物对

4号AC1Pst-F×ACMV_ PRO_SacI-R引物对

5号Rep检测-F×Rep检测-R引物对

6号ACMVORI -R×ACMV_PRO-Xhol-R引物对进行普通的PCR扩增，再根据PCR产物的电泳条带来择出最佳的引物对，PCR的体系及条件详见1。2。5。

 3。8 定量PCR     

    将已经检测过病毒基因组的DNA按照定量PCR的步骤和条件详见1。2。2，加入各组分，最后计算结果和制图。