4  纯合株系的筛选及表型观察。16

  4。1  转基因番茄T1代株系筛选。。16

  4。2  T2代纯合株系的获得和表型观察16

  4。3  实验结果及分析。。16

   4。3。1 转基因番茄T1代幼苗生长状态记录。16

   4。3。2 T2代番茄植株生长过程。。16

   4。3。3 纯合T2代成熟植株表型观察。17

5 讨论。18

参考文献19

致谢。。20

引言

番茄（Solanum lycopersicum）是茄科茄属番茄亚属的多年生草本植物，原产于中美洲和南美洲，现作为全球重要的食用果蔬在全球广泛种植。番茄是肉质果实研究的模式植物。它适于实验室培养；从开花到结果的生育周期短；遗传背景清晰。作为遗传模型，主要体现在乙烯和上游转录因子方面的研究。论文网

番茄果实品种类型丰富、风味独特，富含钾、叶酸、维生素、胡萝卜素和多酚类化合物等多种微量营养元素和植物化学物质，尤其是果实中含有的番茄红素，有助于降低人类罹患心血管疾病和癌症的风险[1]。因此，番茄鲜果及加工产品在全球消费很高。随着转基因技术的成熟与发展，越来越多的转基因番茄已被研制成功，并逐步走向产业化阶段[2]。近年来由于频繁发生的灾害天气和番茄主栽培品种的单一化，导致番茄主产区土壤肥力衰减、酸化加剧、品种优势特征衰减、田间缺陷增加，造成番茄品质及产量下降。因此，除了综合配套栽培、运输、保鲜技术集成的突破，加强优异种质资源的发掘、提高综合性状、选育优良的栽培品种成为了番茄产业健康快速发展的关键，其中分子遗传杂交手段则极大地加速了高产优质多抗专用番茄新品种的培育进程[3]。

在研究果实的成熟机制中，番茄得到了广泛的研究，特别是对于不同成熟突变体的研究[4]。番茄果实的成熟可分为4个主要的阶段：未熟期、绿熟期、破色期和红熟期，每个阶段都受到严格的调控。Cnr突变体的果实大小及种子发育正常，但均不能成熟，无明显的呼吸跃变，外源乙烯不能使其恢复野生型表型，这就意味着突变体果实的成熟调控体系存在缺陷。

在这些已发现的番茄果实成熟突变体中，有很多突变体都得到了深入的研究，从而揭示了很多番茄果实成熟所涉及的途径及影响因子，对进一步了解果实成熟机制作出了巨大贡献[5]。研究发现DNA甲基化相关基因的沉默影响Cnr果实成熟[6]。番茄中有8个甲基化相关的甲基转移酶基因[7]。本课题选择其中的SlMET1基因沉默处理，来研究其对于番茄果实成熟的影响。

1 材料与方法

1。1  实验材料

 番茄野生型株系AC（Ailsa Craig），为本课题组所有；pRNAi-LIC由清华大学刘玉乐教授馈赠。

1。2  实验方法

1。2。1 番茄果实总RNA提取

利用Qiagen公司提供的RNeasy® Plant Mini Kit试剂盒进行如下操作：

1）取新鲜的番茄果实材料100mg，加入液氮迅速研磨，至粉末状；

2）将上述粉末转移至1。5ml RNase-free离心管中，加入含1%β-巯基乙醇的裂解液RLT 450μL，剧烈混匀后置于12000 rpm离心2 min；

    3）取上清液，转移至QIAshredder spin column中， 12000 rpm离心1 min；

4）将滤液转移至新的1。5 ml RNase-free离心管中，加入0。5倍体积的无水乙醇，混合均匀后转移至RNeasy Mini spin column中，12000 rpm离心1 min；

5）弃滤液，加入洗脱缓冲液Buffer RPE 500μL, 12000 rpm离心30 s，弃滤液，然后重复上述操作一次；

6）12000 rpm空柱子离心2 min；