7）将RNeasy Mini spin column转移至新的1。5 mlRNase-free离心管中，加入50ul RNase-free 水，于室温静置2 min后12000 rpm离心1 min，滤液即为所得的番茄果实总RNA。

1。2。2 RNA反转录成cDNA

利用Tiangen公司提供的逆转录试剂盒FastQuantRT Kit (with gDNase)，进行如下操作：

1）按照下表配制混合液，混匀，然后置于42℃孵育3min，然后置于冰上。

组成成分 使用量

5×g DNA Buffer 2μl

Total RNA 1μl

RNase-free water 补足到10μl

2）在上述体系中依次加入如下试剂，混合均匀后置于37 ℃孵育15 min， 85℃孵育5s后得到的cDNA，稀释5倍可用于后续实验。

试剂 使用量文献综述

10×Fast RT Buffer 2μl

RT Enzyme Mix 1μl

FQ-RT Primer Mix 2μl

RNase-free water 补足到10μl

1。2。3 RT-PCR反应

    RT-PCR所用的引物：

PCR1引物 PCR2引物

Primer1: 

5’-CGACGACAAGACCCT-CTGC  TAGCGGCACAACC-3’ 

Primer2:

5’-GAGGAGAAGAGCCCT-ATTTGCCTGTGCTTGTGC-3’

Primer 3 (LIC3-TT-LIC2):

5’-CCAGCACGGAACCCTTGAGGAGAAGAGCCCT-3’

Primer 4 (LIC4-TT-LIC1): 

5’-AGAGCACACGACCCTTCGACGACAAGACCCT-3’

1）将下列试剂在冰浴上依次加入200μl PCR管中：

试剂 使用量

双蒸水 33μl

模板cDNA 1μl

5×PS Buffer 10μl

2。5mM dNTPs 2μl

Primer1（10μM） 2μl

Primer2（10μM） 2μl

2。5U/μl PrimerSTAR HS DNA聚合酶 0。2 μl

总体系     50μl

2）按照如下参数设置进行PCR 扩增反应：

95℃预变性    2 min来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

95℃变性      30s

58℃退火      30s    30 cycles

72℃延伸      30s

72℃终延伸    10min

16℃降温     30 min

END

3）反应结束后，对PCR产物进行电泳检测，并对正确的片段进行割胶回收，并记为PCR产物 P1。

4）以PCR产物 P1为模板，以primer 3和primer 4为上下游引物，参照上述PCR加样体系和PCR 扩增参数进行PCR反应，并对得到的PCR产物进行电泳检测和割胶回收，记为PCR产物 P2。