2。2。1  菌种 6

2。2。2  质粒 6

2。2。3  工具酶和试剂盒 6

2。2。4  分子量标准 6

2。2。5  化学物质 6

2。2。6  缓冲液及其他常用液 8

2。2。6  培养基 9

2。2。7  主要仪器及设备 9

2。3  分子克隆基本操作 9

2。3。1  大肠杆菌基因组的抽提 10

2。3。2  大肠杆菌质粒的抽提 11

2。3。3  大肠杆菌感受态的制备 11

2。3。4  质粒和连接产物的转化 12

2。3。5  琼脂糖凝胶电泳 12

2。3。6   SDS-PAGE电泳 12

2。4  实验方法 13

2。4。1  实验方法简图 13

2。4。2  克隆 13

2。4。3  表达 14

2。4。4  细胞破碎 14

2。4。5  纯化 14

2。4。6  浓缩 15

3  实验结果及分析 16

3。1  克隆载体的构建 16

3。1。1  质粒pET28a+准备 16

3。1。2  引物设计 16

3。1。3  MsbA基因的扩增 17

3。1。4  TA克隆 18

3。2  转运蛋白MsbA的表达 23

3。2。1  转运蛋白MsbA的预表达 23

3。2。2  转运蛋白MsbA的大量表达 24

3。2。3  转运蛋白MsbA的纯化 24

3。2。4  转运蛋白MsbA的浓缩 25

3。3  实验结果分析 25

4。讨论 26

结  论 28

致  谢 29

参 考 文 献 30

1  引言

    生物膜是一个即平凡又神奇的存在，它遍布于细菌、植物、动物的细胞中，是一种每个细胞都有却必不可少的重要成分。细胞与外部环境进行物质的运输、能量的转换和信息的传递都离不开细胞膜，正因为有这样的功能，所以给细胞提供一个安全并且相对稳定的内部环境。所以，生物膜保证了细胞生命活动高效、有序地进行，对于细胞的存活至关重要。目前，人们利用生物膜的选择透过性进行各种科学探索与研发，如：用细胞吸收离子。而细胞膜的选择透过性又与细胞膜上的膜蛋白息息相关。我们利用克隆技术构建表达载体，再导入能承受相应膜蛋白的毒性的宿体中，通过诱导外源基因在宿体中表达来得到膜蛋白。再利用表达出的蛋白的特异性进行纯化筛选来得到高浓度、高纯度的蛋白，通过质谱分析其与底物结合的机理。