1。5  MsbA转运蛋白的纯化策略

    膜蛋白质在天然生物体中的数量是非常低的，因此一般的天然生物体不太适合作为制备膜蛋白质的原材料。而且在生物体中表达出来的目标蛋白常常因为缺乏了足够的插膜过程及折叠过程,或缺少了翻译后修饰,而导致这类蛋白的表达量永远比可溶性膜蛋白的表达量少了一个数量级，且异原过表达的膜蛋白质经常表达量较低或者无活性。此外,过表达的膜蛋白是有毒的，会造成细胞中毒，所以选择表达菌株时要选择能抗毒性的。因此在这两种情况下想要表达出、纯化出并分析出膜蛋白质都是极大的挑战。出人意料的是,迄今为止大量的膜蛋白质,尤其是细菌来源的膜蛋白质,已经被成功的过表达、分离纯化并在分子水平上加以鉴定[[[] 丁晓萍。 膜蛋白的纯化[J]。 生物产业技术, 2009(3):89-94。]]。目前世界上的 许多科研工作者对膜蛋白质的研究正在不断深入和扩展，对膜蛋白质进行分离操作也已经开始出现多样化，比如差速离心法、盐析法、有机溶剂沉淀法等。这些方法对于进行膜蛋白质纯化的研究是非常有用的。文献综述

1。6  ESI质谱分析与动力学研究

    我们常用气液两相连用质谱来分析MsbA转运蛋白的三维结构，及其三维结构下蛋白与脂质、基底竞争性结合。所以，既要能够识别MsbA转运蛋白需要结合的对象又要能表征它们相互作用的强度，了解生物分子的功能是至关重要的。这导致了一个利用非常多样化的生物物理技术来研究配体结合过程的研究高潮，通常是基于分子的光谱性质或与结合过程相关的热改变和问题[[[] 陈绍农, 潘远江。 多肽及蛋白质质谱分析新进展[J]。 质谱学报, 1995, 16(3):15-21。]][[[] 褚福亮, 王福生。 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用[J]。 世界华人消化杂志, 2002, 10(12):1431-1435。]]。这些测量通常是集合测量的可观察包含自由和束缚态的贡献。质谱（质谱）已被证明是一种有用的方法蛋白寡聚状态的评估，并结合化学计量学完整地估算蛋白质与配体结合的结构和稳定性。通过离子迁移率（即时通讯）的耦合进一步提供了新的理论基础，增强了微软的能力蛋白质的结构和动力学，并用于药物的发现和发展。在这里，我们描述了一种方法，涉及使用的蛋白质的气相稳定性表征IM-MS（质谱-离子迁移）[[[] 张伟, 张纪阳, 刘辉,等。 蛋白质质谱分析的无标记定量算法研究进展[J]。 生物化学与生物物理进展, 2011, 38(6):506-518。]]。方法量化蛋白质的抗在气相，这可以显着调制展开配体结合。通过测量这种稳定性的变化，特定的配位体的相互作用，即使在系统中各种复杂的膜蛋白溶解在各种洗涤剂后脂质组件都可以识别。个体的结合状态可以被唯一地确定并且配体结合影响可以用前所未有的灵敏度测量。我们表明，在这种情况下膜蛋白质，可以很容易地区别出特定的脂质结合和洗涤剂的背景信号，另外复杂的分析证明了这种方法不可忽视的潜力。在我们的方法中，稳定分析前弱结合的分子，如洗涤剂或其他的溶解分子首先从气相的蛋白质中去除。配体的结合是通过蛋白质复合体的质量变化所证明的在非变性条件下是容易确定的。这个由于配体结合蛋白稳定性的影响探讨用碰撞诱导展开内部质量光谱仪。在这个过程中，蛋白质离子被加速通过在中性气体的存在下，进行碰撞的细胞碰撞活化。激活使蛋白改变构象，通常由部分展开，但仍然可以有足够的温柔保留第四维结构。通过改变电压的程度可以直接影响用于加速离子进入碰撞细胞活化。重要的是，通过碰撞激活发生在进入质谱仪的流动性细胞，平均气相碰撞截面（CCS）值（有效面积）的折叠和展开的离子可以在一个单一的米/值的值，能够检测和量化的构象变化。作为加速的函数的展开电压，气相稳定性的复合物可以确定下来，在一种类似于蛋白质稳定性的方式从变性方面分析其行为。配体结合的体现它本身作为蛋白质的变化-配体的稳定性配位体的自由形式，在我们的方法中利用的属性。以前的研究已经观察到稳定的配体的影响通过碰撞诱导展开的气相结合，与各种各样的近似方法来评估差异在稳定。这些措施包括一个近似的中点之间的最小和最大的物种，观察，或在展开轨迹中注意到不同的模式。这些分析为方法提供了灵感在这里实现的软件，这是基于亨等人的工作。在稳定的折叠地道离子，在不同的束缚态来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-，被跟踪作为一个函数碰撞活化。然而，利用丰富的信息碰撞引起的展开测量已经阻碍了与高容量处理相关的挑战实验数据和缺乏合适的定量手段提取可靠的结合参数。为了解决这些问题，在这里，我们目前的实验方法耦合用新颖的软件处理和严格分析高IM-MS数据量[[[] Allison T M, Reading E, Liko I, et al。 Quantifying the stabilizing effects of protein-ligand interactions in the gas phase[J]。 Nature Communications, 2015, 6。]]。该软件适合碰撞引起的展开的数据到一个展开的模型，提供了一个准确的配体结合对气相蛋白的影响稳定性和证明是唯一擅长分析具有挑战性的蛋白质复合物，如生物中所遇到的膜。