双酚A对大豆种子萌发及幼苗生长的影响(2)
2．试验方法
2.1试剂配制
1、配制75%的乙醇溶液，用以试验的大豆种子消毒。
2、分别配制0、1、20、50mg/L的双酚A溶液，现用现配。
3、配制霍格兰氏营养液，其配方如下：
营养液所需药品 浓度 微量元素液 浓度 铁盐溶液 用量
四水硝酸钙 945ml/L 碘化钾 0.83mg/L 七水硫酸亚铁 2.78g
硝酸钾 506mg/L 硼酸 6.2mg/L EDYA-Na 3.73g
硝酸铵 80mg/L 硫酸锰 22.3mg/L 蒸馏水 500mL
磷酸镁 493mg/L 硫酸锌 8.6mg/L ph=5.5
铁盐溶液 2.5ml/L 钼酸钠 0.25mg/L
微量元素液 5ml/L 硫酸铜 0.025mg/L
氯化钴 0.025mg/LPh=6.0
2.2双酚A处理下的种子
选择均匀饱满的大豆种子，用75%的乙醇浸泡消毒8s后用蒸馏水冲洗3遍。采用常规的纸床发芽法[3]，使用12cm的培养皿，培养皿内铺两层滤纸，然后将冲洗干净的大豆种子置于其上，每皿100粒种子。用上面4个浓度的双酚A溶液对其处理，每个培养皿中加入约250mL的溶液。每个处理均三个重复，每12小时换一次处理液，对照组中添加蒸馏水，将各处理培养皿放入HZQ-F160全自动光照培养箱,恒温为25度，黑暗条件下培养。发芽期间每隔24h记录一次种子发芽数,并不断补充相对应的双酚A溶液，每天统计发芽数。
2.3幼苗的培养
本试验分为两种处理：一为水培[4]，二为土培[5]。条件为温室，每天黑暗11小时光照13小时，温度为25度。
2.3.1水培大豆幼苗
选取各浓度条件下发芽良好一致的幼苗30棵，放于铺有两层滤纸的培养皿，每个培养皿内添加相同浓度的霍格兰氏营养液，营养液中营养液高度为刚没过发芽的大豆种子，使发芽的大豆种子迅速长成幼苗。处理组中添加的为含有上述不同浓度的双酚A营养液，每天浇一次，每次约为30Ml[7]，对照组每皿每次添加营养液，用量和次数与处理组相同。每个处理30株，三次重复。从开始试验的第15天取样，每个处理随机取样，测定其叶绿素含量。
2.3.2土培大豆幼苗
选取长势良好一致的发芽种子于营养土中培养，每盆装营养土1.0kg,土中BPA的添加比例为0、1、20、50mg/kg,混匀，每盆种植30株,随机排列于温室中，每天用蒸馏水浇灌。所有处理重复3次，第15天取样测定。
2.4幼苗相关指标的测定：
2.4.1种子发芽势和发芽率的测定
发芽期间每天记录发芽数，第三天计算发芽势，第优尔天测发芽率[8]，第七天选取有代表性的10株幼苗测大豆芽长。
计算公式：
发芽势(%)=（第4天内正常发芽的种子数/供试种子数）×100%
发芽率(%)=（第6天内正常发芽的种子数/供试种子数）×100%
2.4.2第15天选取有代表性的幼苗测芽长、根长、株高、叶面积及叶绿素含量[9]。
1、芽长、根长、株高用细线、直尺测定。
2、叶面积用叶型称重法测定[6]。
3、叶绿素含量的测定
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度，即利用公式计算出提取液中各色素的含量[6]。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b的含量，只需测定该提取液在两个特定波长下的光密度OD，并根据叶绿素a、b在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
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