由于土壤环境的复杂性和培养条件的限制，土壤微生物中仅有0。2%左右的种类能够培养，若以培养技术为基础来研究土壤微生物生态就会丧失较多信息[3] 。随着分子生物学的理论与技术在微生物生态学研究中的不断渗透，微生物多样性的研究有了新的突破。而以16S r-DNA序列分析作为微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同[4] 。

2。 实验材料与方法论文网

2。1 土壤样品采集

    实验器材：无菌保鲜袋

    采样于淮安农村的某莴苣田，随机选取几处采样点。选取莴苣根部的土壤作为土壤样品。

2。2 制备土壤稀释液

    实验器材：土壤样本、超纯水、无菌试管、无菌吸头、无菌三角瓶、摇床、电子天平。

    实验过程：用电子天平秤取1。0g莴苣田土壤样品放入盛有99ml超纯水的无菌三角瓶中，放入摇床中震荡10min形成均匀的悬液。使用移液枪从三角瓶中吸取1ml土壤悬液，加入装有9ml超纯水的无菌试管中混合均匀，标记为10-1稀释液。再从该10-1稀释液的试管中吸取1ml液体，加入下一支装有9ml超纯水的无菌试管中混合均匀，标记为10-2稀释液。以此类推，获得10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8八个稀释梯度的土壤稀释液。

2。3 培养基与试剂

    LB培养基（g·L-1）：牛肉膏5。00g，蛋白胨10。00g，NaCl 10。00g，去离子水1000 mL，pH7。0～7。2，固体培养基加琼脂粉1。5 g/100 mL。

    DNA电泳缓冲液TAE：配制50倍浓TAE（pH8。5），2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA；电泳时或配制琼脂糖凝胶时用去离子水稀释至1倍浓TAE缓冲液。

    菌株鉴定过程中用到的taq酶等分子试剂购自溥博生物科技（徐州）有限公司。

2。4 涂布培养

    实验器材：涂布器、LB培养基

    实验过程：将占有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧30s,然后冷却8～10s。吸取50ml菌液，滴加到培养基表面。用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面，涂布时转动培养皿，使涂布均匀。将涂布好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将培养基倒转，放入37℃温箱培养48小时，标注不同稀释浓度的培养基标号以便区分。

2。5 划线培养

    实验器材：接种环、移液枪、移液管 、LB培养基

    实验过程：将接种环放置于火焰上灼烧至发红，然后在火焰旁冷却接种环。将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液（过程中一定要注意防止菌液被杂菌污染）。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划五至六条平行线，盖上皿盖（注意不要划破培养基）。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三区域内划线。注意不要将最后一区域内的划线与第一区相连。将平板倒置，放入培养箱中培养。文献综述

2。6 菌株16S r-DNA的扩增与序列分析

2。6。1 PCR扩增原理

    以细菌的基因组DNA为摸板，采用通用引物扩增菌体的16S rDNA序列，引物正向序序列：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向互补序列为： 5'-TTCAGCATTGTTCCAT-3'。

    PCR反应体系（50μL）为：2×Taq聚合酶反应缓冲液25 µL，DNA模板1µL，Primer F (10µM) 1µL, Primer R (10µM) 1µL, 加无菌水至50 µL。

    PCR扩增反应条件: 预变性94℃ 5 min; 变性94℃ 30 s，退火 54℃ 30 s，延伸72℃ 1。5 min, 30个循环；最后72℃延伸20min，降温至10℃保持5 min。