基于末端转移酶延伸放大的电化学DNA传感器设计(4)
巯基修饰的探针在金表面固定的原理明确，操作简单。但有人认为巯基化探针直接结合到金表面，DNA链之间会有强烈的相互作用，DNA可能在金表面以平躺的方式存在，不利于与溶液中互补DNA链杂交。
1.2.3 氨基修饰的DNA（H2N-ssDNA）探针的固定
氨基修饰的DNA探针在金电极上的固定方法与巯基修饰的DNA探针的固定方法类似。氨基修饰的DNA探针是利用在DNA末端用氨基修饰，金电极表面用羧基或活波酯基团修饰，利用氨基和羧基的之间的缩合反应形成酰胺键，将DNA共价结合在金电极表面。
Wrobel等【7】用16-巯基十优尔酸处理金表面，在金表面自组装形成致密有序的外端为羧基的单分子层。在共价偶联活化剂的作用下，探针的氨基与金表面的羧基反应形成酰胺键，从而将探针固定在金表面。与上述在金表面修饰羧基并进行活化的方法略有不同，Peng等【8】预先合成一个带有活泼酯基团的含硫化合物TAPD（N-[6-(thien-3-yl)acetoxyl]–pyrrolidine- 2,5-dione），TAPD在金表面上自组装形成单分子层，然后与探针作用，使探针共价固定在金表面，固定过程见图3。TAPD是一个导电的分子，在55℃和92℃均能保持电化学活性，意着这个交联化合物在DNA杂交的温度变化范围内是稳 定的。通过TAPD在金表面固定H2N-ssDNA，整个过程只需要不到 40min，大大缩短了固定时间，简化了固定程序，具有一定的优势。
氨基修饰的DNA的固定方法操作简单，所需时间也较短，是一种较常用的方法。
1.2.4 生物素修饰的DNA（biotin-ssDNA）探针的固定
生物素—亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS）几乎可与目前研究成功的各种标记物结合。生物素—亲合素与标记试剂高亲合力的牢固结合及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。利用生物素和亲和素的特异性结合作为桥梁，可将DNA牢固的固定到金表面。而且生物素分子易于活化，与核酸分子偶联率高，且不影响核酸的生物活性【9】。
亲和素在金表面的固定大致可以分为三类：（1）金表面用羧基修饰，通过羧基与亲和素中的氨基反应形成酰胺键，将亲和素共价固定在金表面，再通过亲和素和生物素的互相作用，将经过生物素修饰的DNA固定在金表面。（2）还是利用生物素-亲和素系统的特异性结合，在金表面预先吸附一层生物素分子，由于一个亲和素有四个亲和素位点，因此结合了生物素的亲和素还和与生物素修饰的DNA进行结合，从而以一种金电极-生物素-亲和素-生物素-DNA的方式将探针固定在金表面。如Kukanskis等【10】用生物素化蛋白质处理金表面，通过蛋白质在金表面的吸附将生物素固定。他们使用流动注射装置，使生物素化小牛血清白蛋白溶液、链亲和素溶液和biotin-ssDNA溶液依次流过金表面，从而形成生物素/亲和素/生物素的固定结构。这种固定方法简单，蛋白质虽然不是共价结合在金表面，但实验结果显示，蛋白质层可以稳定20h，在超过12 h的杂交过程中，分子的脱落是可以忽略的。（3）亲和素固定在负电聚合物修饰的金表面，亲和素分子在中性环境中带正电，通过与带负电的物质之间的经典吸引将亲和素结合到金电极表面。
生物素-亲和素系统的结合速度快，特异性强，形成的聚合物非常稳定，多次洗涤，溶液PH变化等操作很难影响其稳定性。而且一个亲和素能连接四个生物素，有利于固定更多的探针，提高检测的灵敏度。此方法的不足之处在于，操作繁琐，成本偏高，所以大规模的推广还需进一步的研究。