FitE RP acgacggccagtgccaagcttTGAGACCGCGATGCAGGT This study

2。1。2  Pf-5菌株基因组的提取

具体步骤如下：

（1）挑取Pf-5菌落接种于KB液体培养基中，28℃，200 rpm摇床过夜培养；

（2）吸取在28℃摇床过夜培养的Pf-5菌落培养液1-5 ml于2 ml EP管中,10,000 rpm离心1 min,尽可能的吸净上清液，收集沉菌；

（3）向菌体沉淀中加入200 μl缓冲液GA，振荡至菌体全部悬浮，37℃处理30 min；

（4）向管中加入20 μl Protein K溶液，混匀；

（5）加入220 μl缓冲液GB，振荡15 sec，70℃放置10 min，溶液变清亮，离心以除去管壁内的水珠；（加入GB后可能会产生白色沉淀，70℃放置后沉淀会消失）。

（6）向管中加入220μl无水乙醇，充分振荡15 s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心后去除管盖内壁水珠；

（7）将上述所得溶液及沉淀全部加入吸附柱CB3中，12,000 rpm离心30 s,弃废液；

（8）向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD（检查GD中是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30 s，弃废液；

（9）向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW，12,000 rpm离心30 s，弃废液；

（10）重复步骤（8）；

（11）12,000 rpm空离2 min，室温静置数分钟以晾干吸附材料中多余的漂洗液；

（12）将吸附柱转入干净的1。5 ml离心管，加入50-200μl的洗脱缓冲液TE，室温静置2-5 min，12,000 rpm离心2 min，收集于离心管中，备用。