DK-8D型电热恒温水槽                                   上海森信实验仪器有限公司

电子天平CP114                                          奥豪斯仪器（上海）有限公司 

1.2  实验方法 

1.2.1 蝉花多糖制备及水提醇沉法提取蝉花粗多糖

称取蝉花干粉0.5克放入50ml离心管中，按照一定的料液比和提取时间在水浴当中提取，然后22℃,5000 r/min离心15min取上清备用。不同提取次数合并上清。上清加3倍体积的95%乙醇，封口，4℃冰箱放置12小时，22℃，5000 r/min离心15min，弃上清，加4.5ml水得蝉花粗多糖溶液。

1.2.2 过氧化氢脱色

粗多糖溶液加0.5ml 30%的过氧化氢混匀（过氧化氢终浓度为3%），60℃保温脱色2小时，打开盖子继续加热15分钟去除过氧化氢。

1.2.3 Sevage法萃取去除蛋白，提取蝉花精多糖

蝉花粗多糖溶液加入2.4倍体积的Sevage（氯仿：正丁醇=5:1）震荡，萃取25min去除杂质蛋白，22℃，5000 r/min离心15min，取最上清液。然后加入3倍体积的95%乙醇并封口，4℃放置4小时，22℃，5000 r/min离心15min，弃上清，晾干即为蝉花精多糖。

1.2.4 苯酚-硫酸法测定蝉花多糖提取率

1.2.4.1 标准曲线的制作

精确秤葡萄糖0.01g用容量瓶定容100ml（100μg/ml），吸取葡萄糖标准液（μg/ml）0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1ml分别加入到各试管中（浓度分别0.5,10,15,20,30,40,50μg/ml），用重蒸馏水补足至每管2ml，各管加0.05ml 80%苯酚溶液，再加入浓硫酸5ml（勿沿管壁加入，以便使样品与硫酸快速混匀），静置10min，30℃水浴15min，在490nm波长处测各管的OD值。以葡萄糖浓度为横坐标，各管的吸光值为纵坐标，利用excel绘制标准曲线，做回归方程。文献综述

 1.2.4.2 样品测定

精多糖加入10ml蒸馏水溶解，取2ml稀释的待测样品（糖浓度控制在10μg/ml-60μg/ml之间），加入试剂量和操作方法同制作标准曲线，测其在490nm波长处的OD值（对照为不加葡萄糖），在标准曲线的基础上，按照回归方程求得多糖相当的量，再计算出样品含糖量。线性回归方程为：A=0.0122C-0.0259。式中：A：待测样品的吸光度；C：蝉花多糖的浓度。