DK-8D型电热恒温水槽                                   上海森信实验仪器有限公司

电子天平CP114                                          奥豪斯仪器(上海)有限公司 

1.2  实验方法 

1.2.1 蝉花多糖制备及水提醇沉法提取蝉花粗多糖

称取蝉花干粉0.5克放入50ml离心管中,按照一定的料液比和提取时间在水浴当中提取,然后22℃,5000 r/min离心15min取上清备用。不同提取次数合并上清。上清加3倍体积的95%乙醇,封口,4℃冰箱放置12小时,22℃,5000 r/min离心15min,弃上清,加4.5ml水得蝉花粗多糖溶液。

1.2.2 过氧化氢脱色

粗多糖溶液加0.5ml 30%的过氧化氢混匀(过氧化氢终浓度为3%),60℃保温脱色2小时,打开盖子继续加热15分钟去除过氧化氢。

1.2.3 Sevage法萃取去除蛋白,提取蝉花精多糖

蝉花粗多糖溶液加入2.4倍体积的Sevage(氯仿:正丁醇=5:1)震荡,萃取25min去除杂质蛋白,22℃,5000 r/min离心15min,取最上清液。然后加入3倍体积的95%乙醇并封口,4℃放置4小时,22℃,5000 r/min离心15min,弃上清,晾干即为蝉花精多糖。

1.2.4 苯酚-硫酸法测定蝉花多糖提取率

1.2.4.1 标准曲线的制作

精确秤葡萄糖0.01g用容量瓶定容100ml(100μg/ml),吸取葡萄糖标准液(μg/ml)0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.6,0.8,1ml分别加入到各试管中(浓度分别0.5,10,15,20,30,40,50μg/ml),用重蒸馏水补足至每管2ml,各管加0.05ml 80%苯酚溶液,再加入浓硫酸5ml(勿沿管壁加入,以便使样品与硫酸快速混匀),静置10min,30℃水浴15min,在490nm波长处测各管的OD值。以葡萄糖浓度为横坐标,各管的吸光值为纵坐标,利用excel绘制标准曲线,做回归方程。文献综述

 1.2.4.2 样品测定

精多糖加入10ml蒸馏水溶解,取2ml稀释的待测样品(糖浓度控制在10μg/ml-60μg/ml之间),加入试剂量和操作方法同制作标准曲线,测其在490nm波长处的OD值(对照为不加葡萄糖),在标准曲线的基础上,按照回归方程求得多糖相当的量,再计算出样品含糖量。线性回归方程为:A=0.0122C-0.0259。式中:A:待测样品的吸光度;C:蝉花多糖的浓度。

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