1材料与方法

1。1 菌株和培养条件

致病菌嗜水气单胞菌TL1是从一只生病的食用甲鱼的肝脏中分离得到的（来自中国浙江某个甲鱼厂），28℃条件下将TL1培养在LB培养基中。大肠杆菌BL21(DE3)pLysS是从北京全式金公司购买得到的，同样28℃条件下，培养在LB培养基中。

1。2 试剂与耗材

实验中常规的生化试剂购于上海生工生物工程技术服务有限公司和北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司。Trizol购自上海英骏（Invitrogen）生物技术公司，琼脂糖购自Sigma公司，限制性内切酶为Fermentas公司产品，引物合成以及测序工作均由上海英骏（Invitrogen）生物技术有限公司完成，所有序列比对于NCBI数据库中完成。

1。3 甲鱼卵的来源与孵化

（1）挖蛋：

到余杭区金鳖园养殖场挖新生的甲鱼蛋，随机选取挖蛋地点，在预算实验所需用蛋量的基础上，考虑甲鱼蛋受环境因素及本质因素的孵化率情况，以及运送过程中的甲鱼蛋破损量，尽可能多挖一些甲鱼蛋以保证实验充足蛋源。此次前往实际挖蛋320个，回校经过各种挑选，最终选取300个作为最终实验用蛋。

（2）编号：文献综述

给300个甲鱼蛋分别对应编号并测其卵径，记录数据。

（3）分蛋：

①铺蛭石：取9个洁净的孵蛋盒，将一定量蛭石和水以1:1混合后，取其适量平铺在每个孵蛋盒的底部；

②编号：给每个盒子编号为1-9，写好编号和每盒甲鱼蛋的孵化温度，并贴好标签；

③入孵：将编好号的甲鱼蛋随机放入上述铺好蛭石的9个孵蛋盒中； 

④封口：给9个孵蛋盒分别盖上一层保鲜膜，用橡皮筋封口。

（4）不同温度孵化：

设置孵化温度梯度：

将编号为1、2、3的三盒甲鱼蛋放入26°C恒温箱孵化，编号为4、5、6的三盒甲鱼蛋放入28°C恒温箱孵化，编号为7、8、9的三盒甲鱼蛋放入30°度恒温箱孵化，并分别在9个孵蛋盒一侧的标签上写上各自的孵化温度。

（5）查蛋：

每天进行查蛋，适当加水，挑出异常的甲鱼蛋，并记录结果：

①将9个封口的孵蛋盒分别从三个不同设置温度的恒温箱中取出，依次打开封口；

②检查每盒甲鱼蛋是否有发霉长毛或者颜色不正常的现象，若有，放在检蛋灯下照射观察，将坏的甲鱼蛋丢弃；

③用手触摸蛭石的湿度，若查蛋时蛭石还较湿润，便不用加水；

④重新用保鲜膜盖上蛋盒，用橡皮筋封口，放回相对应温度的恒温箱中孵化保存，等待下一次查蛋。

（6）幼体孵出饲养来*自-优=尔,论:文+网www.youerw.com

孵化中的甲鱼蛋陆续破壳而出，将孵出的幼体甲鱼按孵化温度（26℃、28℃、30℃）分区域置于恒温室中，放入装有一定水的饲养盒中喂养待用（注：每周2~3次饲喂鳖粮，每次2~3粒，并定期换水，以浑浊程度为准）。

1。4 Pshsp70基因的克隆

将孵化温度为28℃的部分甲鱼幼体带至实验室，取其肝脏组织，迅速冻存于液氮中保存待用。

1。4。1基因的扩增及序列分析

依据基因库中的Hsp70的序列来设计引物F1/R1(见表1），EcoRV酶的位点为表中下划线所标记的序列。