95%酒精 5 min

0。1%固绿染液 40 sec

95%酒精 5 min

纯酒精 5 min

1/2二甲苯+1/2纯酒精 5 min

二甲苯 min文献综述

1。2。9  封片镜检

使用加拿大树胶对制作好的切片进行封固，数天后凝固即可镜检。

1。3  内生真菌的分离和纯化

1。3。1  培养基及配方：

1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：

马铃薯（去皮）100 g，葡萄糖10 g，琼脂5-7 g，水500 mL。

具体制备操作如下：

先将马铃薯洗净去皮，称取100 g，切成1 cm × 1 cm的小块，用4层纱布包好置于沸水锅中煮20-30 min后，用四层纱布过滤出滤液，弃去土豆；向液体中加入5-7 g琼脂，继续加热并不断搅拌，待全部溶解后再加入10 g葡萄糖，不断搅拌至溶解；定容至500 ml，置于灭菌锅中121℃灭菌20 min；待培养基降温至60℃左右，在超净工作台中向其中加入50 mg/mL的链霉素（str）500 µL，摇匀，倒平板20个，置于28℃恒温箱培养2~3天，确保培养基本身未被污染。

2）马铃薯葡萄糖液体培养基（PD）：制备方法同上述，仅不加琼脂即可。

1。3。2  内生真菌的分离和纯化

从大棚取三叶青多年生块状老根（经过试验发现，新生块根含菌量少且不易分离），自来水冲掉表面泥沙，除去根毛部分，用洗洁精浸泡10 min，冲洗干净后，将块根浸泡在稀释一倍的NaClO溶液中灭菌30 min，再用无菌水冲洗 3-5 次。于超净工作台中将三叶青块根切割成厚度为3-5 mm的小块，置于含链霉素(50 mg/mL)的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，切面朝向培养基，每皿放置4-5块，于28℃恒温培养箱中避光培养。同时在超净台中放置2个敞开盖子的PDA平皿以检测操作环境的洁净度，将上述同样处理过的块根未经切割直接滚印于对照皿，并取最后一次漂洗过的无菌水涂布于对照平板，用于检测材料表面灭菌效果。对照组于相同条件下进行培养。

逐日观察菌落表面形态、颜色、质地、生长速度以及边缘形态等。待菌丝体从三叶青块根切面长出时，选取形态不同的菌落菌丝，挑取其边缘部分转移到新的PDA培养基，重复几次纯化至获得纯培养物。来,自,优.尔:论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

1。3。3  保菌

向50 ml锥形瓶中倒入约20 mL PD培养液，用枪头挑一部分纯化菌落的菌丝或孢子，伸入培养液中摇匀，封好口，标记，于28℃，100 rmb/min摇床摇一周左右，观察。若没有细菌污染，则可将摇好的菌落用枪头打散，吸取菌液和50 %甘油以1:1的比例保存于保菌管中，并标记，置-80℃冰箱中保藏，以备后期检测和活化所用。