双光子显微成像实验及理论分析研究(2)
如今显微镜主要分为两类：电子显微镜和光学显微镜。前者的工作基于电子光学原理，其构造类似于光学显微镜，分辨率可以达到纳米量级（0.2nm)，但是对于工作环境的要求更加严苛，价格也更加昂贵，因此无法实现广泛的运用。与之比较，光学显微镜分辨率一般达到微米量级（0.2µm)，而且造价便宜，易于操作，迅速发展成为了如今的主要观察辅助工具，使得人类的观察进入了微米世界。在如今的21世纪里，显微镜的不断发展推动了材料、医学、工业等各个领域前进的脚步。
1.1 各类显微镜的介绍
1.1.1 普通光学显微镜
普通光学显微镜利用可见光作为光源，由光学系统和机械装置组成。光学系统中主要有目镜、物镜、聚光器、光阑和光源；机械结构主要有镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋。显微微镜的光学部分主要有短焦距物镜和长焦距目镜，物体通过物镜形成一个放大的实像，这个实像成为物体，再一次通过目镜成为放大的二次虚像，最后通过眼睛的晶状体成像在视网膜上[1]（见图1.1）。
图1.1 显微物镜的一般光路图
1.1.2 荧光显微镜
利用一定波长的光（波长在250~400nm）作为光源，在其作用下，有些物质可以吸收光能，受到激发后释放较长波长的光波(400~800nm)，即所谓的荧光。荧光一般具有这些特征[2]：
1.在单光子激发荧光的过程中，物质吸收激发光释放荧光，释放的荧光波长长于激发光波长，同时能量相对较低，荧光光强一般较弱；
2.不同物质的荧光特性是固定的，在受到特定波长的激光照射时，物质会释放出相应的荧光，可以通过释放的荧光波长来确定探测的物质成分；
3.荧光是冷光，极易受损消失，通常存在的时长为 s；
4.荧光的衰减是指物质在特定波长激发光照射时，因为光漂白减弱释放的荧光光强的现象。而处于激发态的荧光的发色团在发生变化时会导致荧光的淬灭；
5.荧光具有偏振性。
荧光可以分为两种：自然荧光和人工荧光。
首先能够产生自然荧光的物质必须要具有生色团和荧光团。生色团是分子吸收光能的基团，而荧光基团的作用则是释放荧光。这些物质可以不用经过人工处理，在高压汞灯的作用下自发的释放荧光。比如我们常见的植物的叶子、动物的血浆、骨质等组织机构，因而荧光显微镜初期就在动植物的观察中崭露头角。一般含有如下化学结构的可以产生荧光：1）碳原子骨架（芳香烃、杂环等）2）分子的几何排布呈现平面结构 3）芳香化合物的芳香环由不同的基团取代（比如-OH,-OR,-CN）
与此同时，很多物质本身不含有荧光基团，所以它们就必须要结果化学人工处理，用荧光色素（能够产生荧光的一种有机化合物）和这些物质结合，在光源照射下通过荧光色素释放荧光。经过不同荧光色素着色的样本，在荧光显微镜作用下通过颜色的反差实现不同的细胞组织的分辨。
荧光显微镜主要有如下特点：
1.荧光波长大于激发光波长；
2.光源要提供足够强度的特定波长范围内的光，使得样本内的荧光物质能够被成功激发。同时由于光在传输过程中不断的衰减和吸收，导致荧光的光强要远小于激发光的光强；
3.具有相应的滤光镜系统：高压汞灯发出的激发光需要通过激发滤光片过滤，得到与样本中荧光物质适应的光波范围。过滤后的光波通过分色镜投射到样本上，样本释放荧光，其穿过物镜、分色镜，到达屏障滤片，让在一定范围内的荧光通过，最后通过目镜到达人眼出进行观察。