如今显微镜主要分为两类:电子显微镜和光学显微镜。前者的工作基于电子光学原理,其构造类似于光学显微镜,分辨率可以达到纳米量级(0.2nm),但是对于工作环境的要求更加严苛,价格也更加昂贵,因此无法实现广泛的运用。与之比较,光学显微镜分辨率一般达到微米量级(0.2µm),而且造价便宜,易于操作,迅速发展成为了如今的主要观察辅助工具,使得人类的观察进入了微米世界。在如今的21世纪里,显微镜的不断发展推动了材料、医学、工业等各个领域前进的脚步。
1.1 各类显微镜的介绍
1.1.1 普通光学显微镜
普通光学显微镜利用可见光作为光源,由光学系统和机械装置组成。光学系统中主要有目镜、物镜、聚光器、光阑和光源;机械结构主要有镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋。显微微镜的光学部分主要有短焦距物镜和长焦距目镜,物体通过物镜形成一个放大的实像,这个实像成为物体,再一次通过目镜成为放大的二次虚像,最后通过眼睛的晶状体成像在视网膜上[1](见图1.1)。
 显微物镜的一般光路图
图1.1 显微物镜的一般光路图
1.1.2 荧光显微镜
利用一定波长的光(波长在250~400nm)作为光源,在其作用下,有些物质可以吸收光能,受到激发后释放较长波长的光波(400~800nm),即所谓的荧光。荧光一般具有这些特征[2]:
1.在单光子激发荧光的过程中,物质吸收激发光释放荧光,释放的荧光波长长于激发光波长,同时能量相对较低,荧光光强一般较弱;
2.不同物质的荧光特性是固定的,在受到特定波长的激光照射时,物质会释放出相应的荧光,可以通过释放的荧光波长来确定探测的物质成分;
3.荧光是冷光,极易受损消失,通常存在的时长为 s;
4.荧光的衰减是指物质在特定波长激发光照射时,因为光漂白减弱释放的荧光光强的现象。而处于激发态的荧光的发色团在发生变化时会导致荧光的淬灭;
5.荧光具有偏振性。
荧光可以分为两种:自然荧光和人工荧光。
首先能够产生自然荧光的物质必须要具有生色团和荧光团。生色团是分子吸收光能的基团,而荧光基团的作用则是释放荧光。这些物质可以不用经过人工处理,在高压汞灯的作用下自发的释放荧光。比如我们常见的植物的叶子、动物的血浆、骨质等组织机构,因而荧光显微镜初期就在动植物的观察中崭露头角。一般含有如下化学结构的可以产生荧光:1)碳原子骨架(芳香烃、杂环等)2)分子的几何排布呈现平面结构 3)芳香化合物的芳香环由不同的基团取代(比如-OH,-OR,-CN)
与此同时,很多物质本身不含有荧光基团,所以它们就必须要结果化学人工处理,用荧光色素(能够产生荧光的一种有机化合物)和这些物质结合,在光源照射下通过荧光色素释放荧光。经过不同荧光色素着色的样本,在荧光显微镜作用下通过颜色的反差实现不同的细胞组织的分辨。
荧光显微镜主要有如下特点:
1.荧光波长大于激发光波长;
2.光源要提供足够强度的特定波长范围内的光,使得样本内的荧光物质能够被成功激发。同时由于光在传输过程中不断的衰减和吸收,导致荧光的光强要远小于激发光的光强;
3.具有相应的滤光镜系统:高压汞灯发出的激发光需要通过激发滤光片过滤,得到与样本中荧光物质适应的光波范围。过滤后的光波通过分色镜投射到样本上,样本释放荧光,其穿过物镜、分色镜,到达屏障滤片,让在一定范围内的荧光通过,最后通过目镜到达人眼出进行观察。
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