本实验室在之前的研究中已经发现，用姜黄素处理肝癌HepG-2细胞后，Egr-1基因的含量变化明显，在此基础上，本研究提取最适浓度的姜黄素处理过的HepG-2细胞的总RNA，得到Egr-1基因的CDS区，以构建能够正确转染到肝癌细胞内的pEGFP-Egr-1哺乳动物过表达载体，从而能够为进一步探讨姜黄素与Egr-1基因之间的关系以及其抑制肿瘤细胞的内在分子机制作铺垫。

材料和方法

1。1 实验材料与仪器

DMEM 高糖培养基（Boster），新生牛血清（四季青），胰蛋白酶（EDTA，酚红，南京凯基），DMSO（Bio Basic），PBS，封口膜（Parafilm），Trizol（Beyotime），DEPC（BBI），AMV 第一链cDNA 合成试剂盒（Sangon），琼脂糖（BIOWEST，G-10），50×TAE（Sangon），溴化乙锭（EB，Sangon），pMD18-T 载体（TaKaRa）， pEGFP-C1 哺乳动物表达载体（Clontech），Xho I 和Hind III（TaKaRa），PCR清洁试剂盒（Axygen），大肠杆菌DH 5α感受态细胞（TransGen Biotech），T4 DNA连接酶（Fermentas），GeneTran 转染试剂（Biomiga），SanPrep 柱式质粒DNA 小量提取试剂盒（Sangon），EndoFree 质粒DNA 大量提取试剂盒（Biomiga），AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒、AxyPrep PCR 清洁试剂盒（AxyGen）、姜黄素（BioBasic），GAPDH 内参（Beyotime），其余生化试剂均为国产。

数显恒温水浴锅（DK-8D，上海精宏），THZ-C恒温振荡器（江苏太仓），CO2 培养箱（HF151，Heal Force），单人双面垂直净化工作台（VS-840-2，上海博讯），倒置显微镜（TS100，Nikon），酶标仪（Bio-RAD 680），全自动正置荧光DIC 显微镜及成像系统（90i，Nikon），离心机（Eppendorf，5417），分光光度计（Eppendorf，Biophotometer plus），水平电泳仪（Amersham Biosciences，EPS 301），凝胶成像系统（Tanon），电子天平（METTLER TOLEDO，PL203），常规PCR 仪（K960）。

1。2 方法

1。2。1 细胞的冻存、复苏与培养

细胞冻存：取对数生长期的细胞进行冻存，否则细胞数目会不够。冻存细胞时先用胰蛋白酶进行消化，消化完成后用枪缓慢注入10%的小牛血清（原培养液中已有10%的小牛血清，所以只需再注入10%）和10%的DMSO，混匀，制成细胞悬液，然后适量分装于专用冻存管中，并用封口膜封闭，在管壁上标注冻存时间、冻存人及细胞的种类，最后放入-80℃的超低温冰箱内保存。

细胞复苏：将冻存管从超低温冰箱中拿出，迅速放到37℃水浴中融化并不断摇晃，复苏过程应快融，防止小冰晶形成大冰晶。冻存管中的培养液全部溶解后，将其转移到含有适量新鲜培养液的细胞瓶中，并放入37℃、5 % CO2 培养箱培养。次日更换等量新鲜培养液以降低DMSO对细胞的损伤。

细胞培养：人肝癌细胞HepG-2贴壁培养在含有10%小牛血清和1%青链霉素的DMEM培养液中，并放置于37℃、5 % CO2 培养箱培养。当细胞汇合度还没达到90%时，如果培养液呈现黄色，即可更换培养液，若细胞汇合度已经是90%以上的，就可以按照1:3的比例进行传代培养。在超净工作台中，先将培养液倒尽，用适量PBS清洗两遍，加入少量胰蛋白酶（刚好能铺满细胞生长面，约1 ml），拧紧瓶盖置37℃培养箱中孵育，当在显微镜下看到细胞形态变圆之后即可将胰蛋白酶倒掉，然后加入适量培养液，用枪轻轻吹打，直至形成均匀地细胞悬液。

1。2。2 Trizol法提取总RNA文献综述

当细胞汇合度达到90%以上时，吸尽培养液，每10平方厘米细胞加入1 ml Trizol（一般六孔板每孔加1 ml），晃动并用枪反复吹打，确保所有细胞裂解（用枪头搅动时通常会产生白色丝状物），然后将其吸至离心管中。室温下放置5分钟，使细胞充分裂解。按每毫升Trizol加入0。2 ml氯仿的量加入氯仿，vortex混匀15秒，冰上孵育30 min后于12,000g 4℃离心15分钟，吸取上清至一新的离心管中。按照每毫升最初的Trizol试剂的量加入0。5 ml的异丙醇，颠倒几次以混匀，然后放在冰上沉淀10分钟。12,000g 4℃离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。接着按每毫升最初的Trizol加入1 ml 75%的预冷的由DEPC水配制的乙醇进行洗涤，颠倒混匀，7,500g 4℃离心5分钟，弃上清。重复以上步骤，后让沉淀的RNA自然干燥。待RNA略干后，加入20 μl DEPC水溶解，于-70℃冻存。