本课题主要研究的是哌啶醇的一种：(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶(S-NBHP)的合成。这是一种十分有用的手性砌块，是抗充血性心力衰竭药物莫瑞林、治疗罕有的细胞淋巴瘤的药物依鲁替尼以及一些天然药物的前体或中间体。

制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法并不多，目前我们是通过上文所述的不对称还原来实现的。对其进行不对称还原是的理论得率高达100%，不像之前使用的外消旋体拆分的路线的理论值（仅为50%）那么低。利用不对称还原有两种方法：生物催化和化学催化，但是化学催化的条件较苛刻、反应效率低还容易产生污染，运用于工业中的可能性不大，因此，生物催化剂介导的不对称合成反应已成为如今备受关注的一种手性化合物制备方法。

利用微生物全细胞中的羰基还原酶催化底物是一条污染少、条件温和、经济实用、具有竞争力的绿色合成路线。在本课题组的前期工作中，已经发现埃切毕赤酵母、高温厌氧杆菌等微生物能够催化哌啶酮不对称还原生成手性(S)-N-boc-3-羟基哌啶。并且对来源于埃切毕赤酵母、高温厌氧杆菌等的酮还原酶基因进行克隆后，在大肠杆菌中表达。因此本课题要做的工作就是对前期的构建的重组菌进行筛选，挖掘出能够催化目标反应的重组酶。

2 实验流程

在前期工作中，已经成功构建了14个醇脱氢酶的重组质粒。本课题在此基础上展开，对该十四个醇脱氢酶进行筛选。

首先，将该十四个重组质粒转化进入表达宿主E coli BL21(DE3)，通过PCR技术与凝胶电泳鉴定此步骤的成功与否；转化成功后，加入诱导剂IPTG，在一定的温度下保温一段时间，使酶表达。最后，以N-boc-哌啶酮为底物，在辅酶NADH的辅助下，测定其酶活性。同时，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质的表达情况进行验证，用气相色谱对生成的产物进行验证。

3 试验方法和材料

3。1 菌种

重组大肠杆菌E。coli BL21 (DE3)1,3,4,5,6,7,9,11,12,13,16,19,20和21。

3。2 培养基的制备

3。2。1 LB液体培养基

    称取1。25g LB粉，倒入250mL锥形瓶中，加入25mL水，轻轻摇晃使其溶解，溶解后再加入25mL水。也可统一配置再分装。配好后高压灭菌。

若要制备含抗生素的LB培养基，则在灭完菌后，冷却至50℃，加入5µl（50 mg/ml）卡那霉素单硫酸盐。论文网

3。2。2 LB培养平板培养基

称取10g琼脂粉，倒入500mL锥形瓶中，加入250mL水使其溶解。溶解后高压灭菌。灭好菌稍冷，待温度降至50℃，加入50µL KNA，摇匀。倒入平板，每个平板约20-30 mL（注：温度要控制好，不能过热失活抗生素也不能温度过低造成培养基提早凝固）。待平板中液体不再流动后，倒置放入37℃恒温箱备用。

若需长时间放置，则可将平板储存于4℃，使用前再倒置放入37℃恒温箱，待平板中的水分蒸发或都在盖子上，方可使用。

3。2。3 主要试剂

如表3-2-1所示。

表3-2-1 主要试剂表

试剂 规格 生产厂家

LB Broth 250g 生工生物工程（上海）股份有限公司

LB Broth Agar 250g 生工生物工程（上海）股份有限公司

卡那霉素单硫酸盐 50 mg/ml 自配溶液

3。2。4 实验仪器

如表3-2-2所示。

表3-2-2 实验仪器表