3。5。2 具体步骤

3。5。2。1 DNA电泳

（1） TAE溶液的制备 取50×TAE Buffer 50mL，加入450mL去离子水，摇匀。

（2）1。0%琼脂糖凝胶的制备 称取0。4g琼脂糖溶解于40mL TAE溶液，摇匀后放入微波炉中，用高火加热2-3分钟，取出后冷却（不可冷却至凝固）。

（3）胶板的制备 待琼脂糖凝胶冷却至50℃左右，加入4µL染色剂，摇匀，倒入玻璃槽内，赶走气泡，插上梳子（注：此步骤需在凝胶凝固前完成）。

（4）点样 待凝胶完全凝固后，拔出梳子，在样品孔中点上适量样和marker。

（5）测定 将玻璃内槽放入已有电泳缓冲液的电泳槽中，连接正负极，打开开关，120V电泳35min左右。

（6）待电泳完成后，在紫外下观察结果。

3。5。2。2 蛋白质电泳

（1）将2×蛋白质电泳loading buffer与等样体积混合，煮沸或在微波炉中高火加热5min，冷却。

（2）装上PAGE胶，点样10微升。

（3）打开电泳仪，150~200V下电泳40min。

（4）取下电泳后的PAGE胶，加入自来水冲洗，加热至沸腾，弃去水溶液。

（5）加入染色剂，加热至沸腾，染上颜色后，回收染色液。

（6）加入自来水冲洗，加热，待胶透明后，在白光下观察胶图。

3。5。3 主要试剂

如表3-5-1所示。

表3-5-1 主要试剂表

试剂 规格 生产厂家

Agarose M 50g 生工生物工程（上海）股份有限公司

50×TAE Buffer 50mL 天根生化科技(北京)有限公司

4S Red Plus核酸染色剂 500µL 生工生物工程（上海）股份有限公司

DNA Marker G 250 preps 生工生物工程（上海）股份有限公司

卡那霉素单硫酸盐 50mg/mL 自配溶液来~自,优^尔-论;文*网www.youerw.com +QQ752018766-

3。5。4 实验仪器

如表3-5-2所示。

表3-5-2 实验仪器表

名称 型号 生产厂家

电子天平 SQP 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司

台式高速离心机 H1650R 湘仪实验室仪器开发有限公司

微波炉 P70D20TL-D4 广东格兰仕微波炉电器制造有限公司

电泳仪 BG-Power 600x 北京百金生物有限公司

3。6 诱导表达

3。6。1 实验原理

大肠杆菌的乳糖操纵子包含三个结构基因：A、Z和Y，分别编码乙酰基转移酶、半乳糖苷酶和透酶。【3】大肠杆菌中的调节基因I编码与操纵序列O结合的阻遏蛋白，决定操纵子是否处于阻遏状态。除此之外，在启动序列P上游有一个代谢物基因激活蛋白结合位点。该结合位点和O序列、P序列共同组成lac操纵子调控区，使上述三种酶的编码基因由同一调控区调节，也就是基因产物的协调表达。根据乳糖存在与否可分为两种情况：若没有乳糖存在，lac操纵子则处于关闭状态。在此状态下，I序列lac阻遏蛋白和O序列结合，阻碍启动序列P与RNA聚合酶的结合，抑制转录的启动；有乳糖存在时，lac操纵子就能被诱导，但是诱导剂并非乳糖本身，而是乳糖在进入细胞后被β-半乳糖苷酶催化，变成异乳糖。异乳糖易于结合阻遏蛋白，改变蛋白构象，阻遏蛋白和O序列解离，转录启动。