名称 型号 生产厂家

电子天平 SQP 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司

单人单面净化工作台 SW-CJ-1FD 上海汇龙仪表电子有限责任公司

电热恒温培养箱 ---- 上海一恒科学仪器有限公司

立式压力蒸汽灭菌锅 LDZX-30FBS 上海申安医疗器械厂

3。3 转化

3。3。1 实验原理

感受态细胞BL21(DE3)是E。coli BL21(DE3)菌株处理所得，在DNA转化过程中是相当常用的菌，最适合非毒性蛋白的表达，主要质粒有pGEX、pMAL和pET系列等。它对噬菌体T7的启动子特别敏感，能高效表达大肠杆菌RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶。T7噬菌体RNA聚合酶整合于BL21的染色体上的λ噬菌体DE3区，它具有四种抗生素：链霉素、四环素、壮观霉素、氯霉素抗性。同时该菌株能有效提高外源基因，尤其是富含AT-或GC-的真核基因在原核系统中的表达水平，补充E。coli缺乏的4种稀有密码子对应的tRNA的作用。【2】

3。3。2 具体步骤

（1）取30-50µL贮存于-80℃的感受态细菌置于若干个预冷的灭菌印管中，在冰浴中融化，使细菌均匀悬浮。

（2）在印管中分别加入3-5µL质粒载体PET-28a（以1：10的比例添加），轻轻摇匀，冰浴30min。

（3）将印管转移至42℃的干式恒温器上热休克90s（注：此步计时要精确）。

（4）迅速转回至冰浴2min，让细胞得以冷却。

（5）加入700mL LB培养基（此处不含kna），在恒温摇床中37℃下，250rmp孵育1h。

（6）从印管中取出200µL液体涂布于预先加入卡那的LB琼脂平板上，待凝胶表面液体不流动后，倒置于恒温培养箱中，在37℃下培养12-16h。

（7）待菌落出现后用牙签或枪头挑菌于装有1mL（含kna）的LB培养液中，每个菌挑两次，在恒温摇床中以37℃，180rmp的条件培养9-12h。

（8）保菌 转化完成后，取200µL与等体积甘油混合，放-20℃冻存。

3。3。3 主要试剂

如表3-3-1所示。

表3-3-1 主要试剂表

试剂 规格 生产厂家

BL21(DE3) 100µL 生工生物工程（上海）股份有限公司

甘油（纯） A。R。 国药集团化学试剂

甘油 50% 自配溶液

3。3。4 实验仪器

如表3-3-2所示。

表3-3-2 实验仪器表

名称 型号 生产厂家

单人单面净化工作台 SW-CJ-1FD 上海汇龙仪表电子有限责任公司

恒温摇床 COS-200B 上海比朗仪器有限公司

加热器 GL-105B 海门市其林贝尔仪器制造有限公司

制冰机 SD-100 上海雪鹿冷机厂

3。4 聚合酶链式反应

3。4。1 实验原理

聚合酶链式反应即PCR技术，常用于在使用DNA进行实验前先进行扩增，这种技术可以说是扩增序列最简单、直接、快速的方式。其主要原理是在温度的变化中使DNA变性、退火、复性，促使聚合酶从引物开始利用所提供的dNTP合成样品DNA链的互补链，将我们所需要的目标区域的拷贝数增加一倍。