DNA扩增最常用的酶是Taq聚合酶，细菌能借助这种聚合酶合成胞内DNA。在实验室中，它可以在高温下正常生长，最佳温度至少为80℃，因其是一种从嗜热水生菌中分离的DNA聚合酶，因此，对扩增技术中需要的反复升温和冷却耐受。Taq酶的基因表达通常以大肠杆菌为载体，在大肠杆菌中表达之后，通过加热可以灭活污染的大肠杆菌蛋白，因此有助于其纯化。这种酶既有5’→3’DNA聚合酶活性，也有3’→5’内切核酸酶活性，每秒钟大约能够聚合50-60个核苷酸。

    本实验即使用PCR技术鉴定DNA的转化是否完全。如果大肠杆菌中有相应的基因，用其做菌落PCR的时候，相当于有模板DNA，PCR能被验证，即转化成功，如果PCR不能被验证，则宿主细胞中不含目的基因，即转化失败。

3。4。2 具体步骤

（1）制备PCR反应液（50µL体系）于PCR管中

  Premix Taq                  25µL

  菌液                        1µL

  Forward Primer 1            1µL

  Reverse Primer 2            1µL

  ddH2O                       22µL

（2）将PCR管插入PCR机中，反应条件如下：

  95℃               5min

  94℃               30sec

  55℃               15sec                ×30次

  72℃               2min（1min/kb）           

  72℃               10min

3。4。3 主要试剂

如表3-4-1所示。

表3-4-1 主要试剂表

试剂 规格 生产厂家

Premix Taq 500 µL 宝生物工程（大连）有限公司

3。4。4 实验仪器

如表3-4-2所示。

表3-4-2 实验仪器表

名称 型号 生产厂家

热循环仪 C1000 伯乐生命医学产品有限公司

超低温保存箱 ---- 海尔

3。5 凝胶电泳

3。5。1 实验原理

在碱性环境中（pH 8。5），DNA和蛋白质均带负电荷，在电场中由负极向正极移动。DNA分子的移动需要支持介质的存在，支持介质作为分子筛，使得小分子比大的更自由地通过凝胶，在凝胶中移动地更快，即可根据不同大小与构象的分子在凝胶中的迁移率不同，分离不同的核酸，最小的分子移动得最远。文献综述

电泳有有很多种类，凝胶电泳是最为常用的一种，其中，最为灵敏、便捷的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶更是实验室的必备。我在此实验中便是采用这两种，通过琼脂糖测定DNA，聚丙烯酰胺则更适合测定蛋白质。琼脂糖凝胶通常在平的板上灌制并进行几百个核苷酸以上的分子的电泳，而聚丙烯酰胺凝胶则是在两块竖直的玻璃板间灌制，适于1kb以上分子的电泳。根据凝胶介质有效孔径的大小以及便于使用的聚丙烯酰胺或琼脂糖的浓度，聚丙烯酰胺凝胶最适合于蛋白质物质的电泳，而琼脂糖则常用于DNA。