酵母组蛋白提取方法的优化与探索(5)
时间:2017-02-10 20:02 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
然而在哺乳动物细胞中，这种现象还有待于进一步研究。早期研究发现，体外甲基化的CpG片段稳定整合到哺乳动物基因组中以后，可以与含甲基化CpG结合结构域（methylbindingdomain，MBD）蛋白（包括MeCP—1和MeCP—2等）结合，进而可以招募包括HDAC的抑制复合物。进一步研究还发现，人MLH基因的甲基化可以引发特异的组蛋白密码组合，以保持基因沉默状态。研究者通过使用DNA甲基化酶抑制剂5—氮杂胞苷（5—Aza），而不使用组蛋白乙酰化酶抑制剂制滴菌素A(trlcostatmA，TSA），可以导致组蛋白甲基化修饰方式的缺失。从这些结果可以看出，在哺乳动物中，组蛋白修饰似乎又是DNA甲基化发生以后的事件。但在哺乳动物中敲除p16基因时发现，染色质修饰并不完全依赖于最初的DNA甲基化。同时，研究者认为组蛋白修饰是ILR2基因沉默的早期事件，启动子区的甲基化是一个逐步增加的过程，DNA甲基化的建立是为了长期文持基因沉默，而不是起始它[17]。 从以上的结果可以看出，表观遗传学过程是复杂的和多层面的，不同的表观遗传修饰也可能存在区域或信号途径的特异性，有很多未知的东西有待于进一步研究。 2.4 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验 莱姆利(U.K.Laemmli)于1970年创建了含十二烷基硫酸钠(SDS)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质方法。向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS，SDS全名为十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去垢剂，它可使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷／质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。是分析蛋白质和多肽、测定其分子量等常用的方法。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。由于SDS—PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE后，就只出现一条蛋白质区带。SDS—PAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径等所组成[18]。 堆积层原理 堆积层含有4-5%的丙烯酰胺，这样堆积层的孔径就相对较大和松散。这一层的目的是让样品在堆积层和分离层的界面浓缩到一个超薄的区域（1-100nm）。当施加电压时，由于蛋白质外包裹着SDS，便使蛋白向正极迁移，由于这层的pH是6.8，甘氨酸在这里呈两性离子状态存在，所以这一层的离子强度便很低，从而形成高电阻,最终形成高电场力，从而使蛋白质的在堆集层的迁移速率高于分离层。另外由于这层的孔径大，所以对一般蛋白质的迁移速率不造成影响； 另外当蛋白质到达堆积层和分离曾边界时，分离层孔径小，首先到达边界的蛋白质速率便减慢，而后来的蛋白质仍然保持高速率迁移，便使得蛋白质在边界处堆积浓缩。 (责任编辑：qin) |