酵母组蛋白提取方法的优化与探索(9)
时间:2017-02-10 20:02 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
③ 所有蛋白样品必须冻存于-80℃细胞房冰箱中。 （五）SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 ① 搭好装置后，按照配方配制分离胶。配置完毕后，从装置中的玻璃板中灌入分离胶，用异丙醇封胶。静置凝固约30-45min。（同时可做另一块胶）。 ② 凝固完毕后，仔细倒掉上层的异丙醇，灌入事先配制好的浓缩胶。迅速插入15孔上样梳。静置凝固约30-45min。 ③ 拆下玻璃板，装入电泳槽的夹板中。用力固定安插，以免上样缓冲液从缝隙中漏出。倒入上样缓冲液至刻度。并小心拔出梳子。 ④ 用针头依次清洗孔中可能残余的胶丝后即可上样。 ⑤ 上样结束后，接通电源与电泳槽之间的电路，设置电压100V，时间20min。 ⑥ 看到标准物Marker出现红色条带时，改变设置电压150V，时间60min。 ⑦ 电泳结束，取出电泳槽的夹板，取下上面的玻璃板，小心仔细地将其中一块胶放入染色碟中，用清水冲洗。 ⑧ 随后加入固定液固定30min。同时将另一块胶取出放入转膜盒中准备转膜。 ⑨ 将固定液倒入回收桶中，倒入考马斯亮蓝染色液染色，并且使染色液完全将胶覆盖住。 ⑩ 最后放置于在摇床上振荡过夜。 （优尔）Western blot蛋白质印迹法 ① 在转膜盒中倒入转膜缓冲液，随后放入转膜夹板，依次按照顺序放入一张厚滤纸，胶，一张NC膜，再用一张厚滤纸完全覆盖住。最后用力合上夹板夹紧。放入转膜槽中。 ② 在转膜槽中的空档中放入降温使用的冰块。将转膜盒中的缓冲液全部倒入转膜槽中。 ③ 接通电源与转膜槽的电路，设置电压100V，时间90min。 ④ 转膜完毕后，将NC膜取出放入染色碟中，用丽春红染色液染色，可见明显清晰蛋白条带。 （七）免疫反应 ① 用清水冲洗掉染色液后，加入封闭液牛血清蛋白BSA封闭膜1小时。 ② 倒掉封闭液，将膜转移入封闭盒中，孵一抗H3-HRP。其可用于调整上样量。而一抗（乙酰化）则与膜上的蛋白质抗原结合。并放于4℃冰箱的摇床上振荡过夜。 ③ 第二天取出封闭盒，回收一抗。用1%PBST溶液洗膜4-5次，每次5min。 ④ 洗膜结束后，孵二抗（3—OH）1小时。其可用来放大一抗的信号。 ⑤ 倒掉二抗，再次用1%PBST洗膜4-5次，每次5min。 ⑥ 洗膜完毕，准备进行曝光。 （八）发色曝光（化学发光） ① 打开计算机和Image J 图像曝光软件，等待曝光仪冷却到-25℃，并设置好各种软件参数。 ② 将1ml曝光液A和1ml曝光液B充分混合于膜上，并使膜完全被曝光液覆盖。 ③ 把膜放进曝光仪进行曝光，调整对比度和亮度，使图像更为清晰，最后得出蛋白条带图像。 4 结果与讨论 4.1 分离所得组蛋白条带结构鉴定 M WT1 WT2 H2O 3-OH M M WT1 WT2 H2O 3-OH M 图（1）丽春红染色组蛋白条带—H3-HRP抗体 图（2）丽春红染色组蛋白条带—3-OH抗体 丽春红是一种可逆的大红色染色液，即用清水漂洗之后它可褪色。它可用来显示从胶上转移到膜上的蛋白条带。当蛋白质印迹法Western blot实验结束后，将NC膜从转膜槽中取出，用丽春红染色液进行染色，相应的蛋白条带即刻会显示出来，在摇床上经过3-5min后，用清水洗去颜色，最后进行图像扫描。可从图像中得出，组蛋白条带一般都在对应的20Kda-15Kda之间出现，而其他的条带属于杂带，可不用深入研究分析。图（1）所用的H3-HRP主要是争对组蛋白结构中的一类H3结构的抗体，它属于一抗（primary antibody），它并不需要再孵二抗体，便可直接曝光。而图（2）所用3-OH抗体属于二抗（secondary antibody），用于放大与NC膜上的抗原结合后的一抗的信号。所以，它在使用此抗体之前，必须先用对应的一抗结合膜上的蛋白。而此实验中使用的一抗是兔抗。(anti-rabbit)。一般情况下，每张膜使用的抗体量约为6ml。 (责任编辑：qin) |