酵母组蛋白提取方法的优化与探索(8)
时间:2017-02-10 20:02 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
④ 分别将锥形瓶中的培养基YPD（呈橘红色，有香）倒于四支50ml试管中，每支约为25ml。 ⑤ 再将酵母细胞wild-type样品分别加入试管中，样品每试管500μl。 ⑥ 试管置于30℃恒温暖箱振荡摇匀过夜培育。 （二）提取酵母全蛋白（Yeast protein Lysates） ① 取出过夜的试管，将其中一支25ml试管用培养基YPD稀释一倍为50ml，混匀充分后再分装到两支25ml试管。一管往酵母细胞中加入3—OH药500μl，另一管则同样加入蒸馏水500μl，用于对照。并再次放入30℃恒温暖箱振荡摇匀过夜。使酵母细胞再次生长。第二天取出。 ② 移取剩余三支试管中的2ml酵母细胞用于提取其组织全蛋白，保留23ml用于提取其组织组蛋白。 ③ 将酵母细胞于离心机中离心（条件：3000rpm 5min 4℃），用1ml蒸馏水洗涤细胞团块，并再次离心。条件不变。 ④ 用2ml蒸馏水重悬细胞团块，分装于三支1.5mlEP管中。（其余23ml步骤相同，结束后冻存于-80℃细胞房冰箱中）。 ⑤ EP管离心（条件：11000rpm 1min）。 ⑥ 分别加入0.5ml 缓冲溶液A于试管中，置于涡旋振荡仪上充分振荡。 ⑦ 分别加入50μl 50%三氟乙酸TCA溶液于试管中，充分涡旋振荡。置于冰上10min。 ⑧ 再次EP管离心（条件：11000rpm 2min 4℃）。 ⑨ 分别用0.5ml丙酮溶液洗细胞沉淀，并置于冰上5min。 ⑩ 再次EP管离心。（条件：11000rpm 2min）离心完毕后，倒出丙酮溶液，并在通风橱中吹干（加药的与对照的全蛋白提取过程相同）。 （三）提取酵母组蛋白（Yeast protein histone） ① 取出冻存于-80℃冰箱中的酵母细胞，分别用1ml缓冲溶液SP重悬细胞团块，并转移到三支1.5mlEP管中。 ② 配制1%SDS溶液。即在约10ml蒸馏水中加入1ml 10%SDS溶液。用于测量OD600-0.8值（也称吸光度）。 ③ 测量OD600-0.8值。 ④ 分别加入60μl用于破裂酵母组织细胞壁的裂解酶。 ⑤ 放置于30℃恒温水浴加热。 ⑥ 再次测量OD600-0.8值（要求：必须低于第一次测量结果值的10%）。 ⑦ EP管离心（条件：4000rpm 5min 4℃）,用1ml缓冲溶液SP洗细胞团块后，并再次离心（条件不变）。 ⑧ 分别用1ml缓冲溶液NIB重悬细胞团块，放置于冰上20min。并再次离心（条件：11000rpm 20min）。 ⑨ 重复第⑧步骤三次。 ⑩ 分别用1ml缓冲溶液A洗涤细胞团块，并置于冰上15min，再次离心（条件：4000rpm 5min）。 ⑪ 重复第⑩步骤三次。最后一次洗细胞时需置于冰上5min。 ⑫ 分别用1ml缓冲溶液B重悬细胞团块，并往试管中逐滴加入111μl 0.2mol/l 硫酸溶液，于4℃冰箱旋转仪上放置过夜。 ⑬ 第二天取出三支EP管，放于离心机上离心（条件：11000rpm 20min）。 ⑭ 移取上层清液于三支新的试管中，分别用500μl 0.2mol/l硫酸溶液和缓冲溶液B再次提取后离心，合并上层清液。 ⑮ 分别加入400μl 100%三氟乙酸TCA溶液于试管中，并置于冰上30min，再次离心（条件：11000rpm 20min）。 ⑯ 分别用1ml丙酮溶液洗细胞沉淀，离心（条件：11000rpm 5min）,并重复一次。最后倒出丙酮溶液，放入通风橱吹干。（加药的与对照的组蛋白提取过程相同）。 （四）处理样品 ① 首先在试管中加入100μl Tris 8.0溶液，再加入100μl Loading buffer上样缓冲液和用于显色的溴酚蓝。 ② 将加过溶液的试管放于恒温孵育器上煮蛋白约30min。（过程包括三次加热过程，三次冷却过程）。 (责任编辑：qin) |