酵母组蛋白提取方法的优化与探索(6)
时间:2017-02-10 20:02 来源:毕业论文 作者:毕业论文 点击:次
2.5 Western blot 蛋白质印迹法 蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治•斯塔克（George Stark）。在尼尔•伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面 Western blot，它又称蛋白质印迹或免疫印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 Western blot技术的一般步骤是将经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤文素薄膜）上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。由于Western blot检测技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，因此可检测到1-5 ng (最低可到10-100 pg)中等大小的靶蛋白。同时，Western blot技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。其大致的过程可分为：SDS-PAGE凝胶电泳实验、转膜实验、免疫反应、化学发光实验、凝胶图像分析[19]。 Western Blot显色的方法主要有以下几种： i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 HRP是一种名叫做优尔根过氧化的标记酶。它可用来来标记抗体或其它蛋白质，既能用于定位检测，也能用于定量测定。用于工、农、医、环保等方面，可用该酶配制的血糖、甘油三脂、胆固醇等生化诊断试剂盒及酶免ELISA测定中的酶标抗体能性[20]。 而值得一提的是，western blot 这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来类似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个针对蛋白质，人们分别把这两种技术称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。 3 实验部分 3.1 实验仪器 在实验过程中所用仪器列表表示如下： 表3.1 实验所用仪器 仪器 测试项目 电子天平 PH计 高压灭菌器 30℃恒温暖箱 Eppendorf 5417R小型冷冻离心机 Eppendorf 5804台式高速大容量离心机 Vortex-Genie 2 涡旋振荡器（Shaker） Eppendorf Biophotometer plus核算蛋白测定仪 水浴加热仪 Eppendorf thermostat恒温孵育器 Bio-Rad SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 （1） 电源 （2） 电泳槽 （3） 玻璃板 （4） 夹板 Western blot 蛋白质印迹法 （1） 电源 （2） 转膜槽 （3） 转膜夹板 恒温摇床 (责任编辑：qin) |