3  讨论 8

致谢 9

参考文献： 9

转录因子SKN7参与水杨酸调控灵芝酸的初步机制研究

前言

灵芝（Ganoderma lucidum）是著名的大型食药用真菌，具有丰富的营养和药用价值，在中国和东南亚国家有着悠久的应用历史[1]。灵芝在抗衰老、提高免疫、抗病毒和抗肿瘤等方面具有很好的疗效，其中灵芝三萜类化合物（灵芝酸）是灵芝的次级代谢产物，它含量的多少已成为评价灵芝质量的重要标准[2-4]。近年来随着灵芝基因组测序工作的完成，以及一系列遗传操作平台的建立，如RNA干扰技术、基因过量表达体系等，有力地推动了灵芝成为一种新型模式药用真菌，显著提高了其科研和商业价值[5-7]。

水杨酸(Salicylic acid, SA)诱导可提高丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B合成积累量、相关酶苯丙氨酸解氨酶，和酪氨酸氨基移转酶活性。在适宜浓度(22 mg/L)条件下，SA诱导处理2d后可使丹酚酸B大量积累[8]。同样地在灵芝中经过外源SA的处理也可以增加灵芝酸的合成量[9]。SA能够诱导丹参植株叶片内ROS积累，ROS是生物细胞各种代谢途径中产生的副产物，其主要在线粒体和过氧化物酶体中产生。在正常条件下，这些分子可以通过特定部位的不同抗氧化防御机制进行清除[10]。然而，在添加外源水杨酸条件下，ROS产生和清除之间的平衡往往受到干扰，导致ROS水平的迅速上升，从而对生物造成损伤。植物防御早期的研究中发现，生物体内存在ROS的迸发现象。真核生物的线粒体是产生ROS的主要场所[4]。ROS的大量产生最先受损的便是线粒体[5]，而SOD2能够通过及时清除呼吸作用产生的ROS，起到保护线粒体的作用。

转录因子SKN7第一次在真菌中被发现以来，有关SKN7的结构和生物学功能的研究已经取得了显著的进展。近年来的研究发现SKN7在抵抗寄主的氧化压力，热激，抵抗高渗环境，细胞壁完整性、孢子形成,自我分解和毒性等诸多方面起重要作用[11,12]。对SKN7在灵芝中的作用之前还未见报道，研究SKN7在水杨酸调控灵芝酸的作用进一步完善了SKN7的生物功能研究。当灵芝中的ROS含量升高时，SKN7基因表达量升高，对ROS起到调控作用。所以推测SKN7参与了水杨酸通过ROS调控灵芝酸生物合成量的过程。

研究SKN7在水杨酸调控灵芝酸的生物合成中的作用及其机制，不仅可以通过对SKN7改造来提高灵芝酸的产量，培育优良品种，更重要的是，将有利于我们从本质上了解对灵芝酸合成的生物调节的生物机制。

1  材料与方法 

1。1 材料

1。1。1 菌株及试剂   

灵芝(Ganoderma lucidum HG)菌株G20由上海农科院提供，并保存在4℃冰箱中，SKN7菌株由实验室提供。其它化学试剂均为Sigma公司或国产分析纯。

1。1。2  菌株培养   

CYM培养基(1L)：麦芽糖10g，葡萄糖20 g，蛋白胨2g， 酵母提取物2g，硫酸镁0。5g，磷酸二氢钾4。6g，琼脂20 g(固体)。

灵芝菌种于4℃保存，菌株在CYM液体培养基(250 mL三角瓶装100 mL)中培养，150 rpm/min，28℃培养7 d。本实验中所有SKN7-5，SKN7-7, SKN7-13菌株皆为SKN7的沉默菌株。

1。2 方法

1。2。1 总灵芝酸含量测定

不同处理的菌丝置于28℃摇床培养7 d，收集菌丝，置于60℃烘箱烘干至恒重，将其研磨成粉状待测。样品制备：精密称取200 mg 60℃烘干菌丝粉，小心放入10 mL容量瓶中，加入95%乙醇定容，超声波破壁2 h，期间每20 min摇动一次，取8 mL 37℃静置过夜，60℃旋转蒸干，加入0。5 mL甲醇溶解，溶解液置于1。5 mL离心管中，离心后，使用一次性0。22 µm有机相滤器过滤，通过UPLC (ultra-performance liquid chromatography)检测。