1。7。抗性菌株的生长条件试验

1。7。1。温度   将菌株分别接种在LB液体培养基，保持其他因素不变，在20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和 40 ℃，进行摇床培养24 h，OD600测定菌体浓度。

初始pH  将菌株分别接种于不同初始pH值（3。0、4。0、5。0、6。0、7。0、8。0、9。0、10。0）的LB液体培养基中，保持其他因素不变，进行摇床培养24 h，OD600测定菌体浓度。

1。8。抗性菌株的16s rDNA序列的系统发育学分析

1。8。1。16S rDNA的PCR扩增

由于16S rDNA序列在原核生物中均具有极高的保守性，已经在研究细菌系统发育分类的过程中成为最常用的分子指标，被称为细菌进化的分子钟。通过对菌株16S rDNA的克隆及序列测定和并进行比较[12]，可进一步鉴定出菌株的分类地位。用细菌的16S rDNA通用引物，扩增出菌株的16S rDNA的片段。扩增细菌16S rDNA的引物为27F(上游引物，序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(下游引物，序列：5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’) [13]。

50μL PCR扩增体系：10×Taq Buffer 5 μL，dNTP(25 mmol·L-1) 2。5 L ，Mg2+(25 mmol·L-1) 4 μL，Taq DNA聚合酶(5U·L-1) 0。5 L， ddH2O 36 μL，上、下游引物(25μmol·L-1)各1 L。聚合酶链式反应（PCR）条件：95℃下预变性5 min；94℃下变性30 s，55℃下退火45 s，72 ℃延伸1。5 min，循环32次；72 ℃延伸10 min[14]。

PCR完成后，进行凝胶电泳，检测结果。

1。8。2。扩增产物切胶回收

采用PCR回收试剂盒(上海捷瑞有限公司Shanghai Generay Biotech Co。)回收16S rDNA的基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小（1。5 kb左右）。

1。8。3。酶连

将DNA酶连到pMD19-T载体上，载体为pMD19 。10 L片段体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1 μL，载体（PMD19-T）2 L，回收的片段6 L，T4 DNA Ligase 0。6 L，ddH2O 0。4 L。为保证片段与载体连接上，片段体系与载体的体积比值约为3:1。4 ℃，过夜。文献综述

1。8。4。转化

将2管100 L含Trans 5α超感细胞在冰上分装成4管，各50 L；每管中对应加入100 L的酶连产物；放置于冰上30 min；45 ℃水浴热激45 s；冰浴2 min；加入500 L的LB液体培养基，置于350 r/min摇床中，恒温37 ℃，培养1 h；在菌体浑浊管中取200 L于含氨苄青霉素（Amp）的LB固体培养基平板（Amp终浓度为50 mg·mL-1）上涂布，37℃倒置培养过夜。

1。8。5。提取质粒

挑取转化DH5α后平板中的单菌，采用质粒DNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的大小（1。5 kb左右）。

1。8。6。测序与分析

TA克隆后进行测序（由南京一道生物科技有限公司完成）。将测得的序列用与EzBioCloud (http://www。ezbiocloud。net/)中已知的16S rDNA基因序列进行同源性比较及分析，下载相近序列，并用MEGA 7。0软件使用Neighbor-Joining法，计算模型为Kimura2-parameter，计算次数为1 000 次，构建系统进化树。

1。9。抗性菌株的耐受性试验

配制Cu2+浓度分别为600 mg·L-1、650 mg·L-1、700 mg·L-1、750 mg·L-1、800 mg·L-1、850 ml·L-1的LB液体培养基试管各4只，其中一只为CK，其余三支为重复处理，共24只。处理组接入预实验中生长良好的菌种的新鲜菌液100 μL ，置于150 r/min摇床中30 ℃恒温培养。7d后以CK为基准测定处理组OD600的值，确定菌株对不同浓度的Cu2+的耐受性。

配制Zn2+浓度分别为1950 mg·L-1、2275 mg·L-1、2600 mg·L-1、2925 mmol·L-1、3250 mg·L-1、3575 mg·L-1的LB液体培养基试管各4只，其中一只为CK，其余三支为重复处理，共24只。处理组接入预实验中生长良好的菌种的新鲜菌液100 μL ，置于150 r/min摇床中30 ℃恒温培养。7d后以CK为基准测定处理组OD600的值，确定菌株对不同浓度的Zn2+的耐受性。