NADH氧化酶的固定化研究+文献综述(4)
（4）Ye-Wang Zhang、Manish Kumar Tiwari等人[5]在2012年从鼠李糖乳杆菌中克隆H2O型NADH氧化酶的基因，并在大肠杆菌BL21中表达，第一个发现具有高活性和热稳定性的重组的H2O型NADH氧化酶，产物中没有H2O2。该酶在80℃的半衰期是120min。这一性质使该酶在NAD+再生和与脱氢酶耦合反应生产稀有糖的工业应用中有重大意义。
1.2 固定化酶技术
1.2.1 固定化酶的研究进展
酶作为催化剂，具有稳定性差、分离纯化成本高、反应后酶活力很难恢复等缺点，
这都限制着酶工业的进一步发展，而这些问题可以通过固定化酶技术来解决。固定化酶技术是将游离态的酶用化学或物理方法处理，使之不溶于水但仍具有酶催化活性的技术。游离态酶不宜长期贮存、活性易于损失、难于重复利用等缺点，一定程度上限制了酶的应用。而酶通过固定化，不仅保持了其催化的高效率和高度专一性，而且还提高了对温度及酸碱的耐受性和稳定性，延长了酶的使用寿命。而且，固定化的酶可以重复多次使用、简化工艺流程、实现操作连续可控，同时具有反应后易与产物分离、减少产物分离纯化的难度、提高产量和质量等优点，所以酶固定化符合可持续发展的战略要求。
目前，酶固定化技术广泛应用于生物化学、生命科学医药、化学分析、生物分离、
能源开发、环境保护等领域。我国已成熟使用固定化酶法进行高果糖玉米糖浆、生物柴油、半合成青霉素和头孢霉素的生产及DL-氨基酸的拆分。
1.2.2 酶固定化方法
酶的固定化方法大致可以分为物理法和化学法，物理法包括吸附法和包埋法，化学法主要是共价交联法.吸附法是指通过物理方法把酶吸附在纤文素、琼脂糖等多糖或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定化方式。
吸附手段主要包括静电吸附、疏水吸附、亲和吸附。吸附法具有吸附可逆、载体可重复使用、操作简单等优点。 但是该方法酶吸附量有限，并容易受到酶分子的空间构型、 载体性质、 溶液pH、离子强度及扩散、底物浓度等方面的影响。
酶的包埋法是将酶包裹在载体中的固定化酶方法，主要分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法两类。把酶包埋在凝胶内部的微孔中为凝胶包埋法，把酶包埋在高分子半透膜中为微胶包埋法。包埋材料的选择对包埋过程极其关键。
共价交联法是利用化学反应对载体的某一基团进行化学修饰，然后利用此修饰基团再与酶分子上的特定基团反应形成共价键的固定化酶方法。该方法常用双功能试剂作为载体和酶的交联剂，如戊二醛、双偶氮苯、己二胺等。共价交联法固定化酶具有酶与载体结合紧密、吸附量大、对酸碱及高温的耐受性高等优点。
纤文素是世界上最丰富的有机化合物，也是人类应用最多的一种高聚糖。纤文素具有开放性的长链和疏松的网状结构，有利于大分子的渗透和吸附，纤文素结构中存在着大量的羟基，可通过各种反应制成多种纤文素衍生物而带有各种活泼基团，因此通过纤文素衍生物固定酶制备具有生物活性的材料受到越来越多的重视，如利用纤文素磁性微球固定半乳糖氧化酶、用纤文素固定葡萄糖基转移酶、利用修饰的纤文素固定虫漆酶，均取得了不错的效果。
本课题采用共价交联法，将硫酸亚铁与纤文素充分混合，以氢氧化钠为沉淀剂使Fe2+和Fe3+均匀沉淀出来，控制氢氧化钠的量和搅拌速度来调节Fe2+和Fe3+的比例（一般反应最终的pH为10左右），再通过热分解法最终制备出纤文素包裹的Fe3O4。纤文素通过高碘酸钠处理，将羟基氧化为醛基，生成二醛纤文素。NADH氧化酶上带有氨基，可以与醛基共价结合。通过双功能试剂(戊二醛等)增强固定化效果，从而将酶固定到纤文素上。Fe3O4的作用是可通过外加磁铁或磁场使固定化酶更利于使用和回收。
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