Figure1。1 Aspartic acid fumaric acid into ammonia generation

（2）固定化酶

固定化酶兴起于20世纪60年代，顾名思义，固定化酶就是将所利用的酶固定在一定区域，起到一定的催化作用，并且能够重复使用。固定化酶有一点与游离酶相似，那就是大多数情况下，在以水为介质的反应体系中催化反应。固定化酶，一般将酶与高分子载体结合在一起，制备方法有化学法和物理法，分别有交联法和包埋法。通过对酶的功能区进行修饰改造，将酶与化学试剂反应，间接改变酶分子间的作用力，提高酶活性。另外，双功能基团也可以通过交联剂交联，从而造成酶分子之间的交叉相连，使酶聚合成更加稳定的结构，进而加强酶的催化性能[9]。酶与高分子化合物的结合（某些蛋白质、多糖等），不仅可改善酶结构，而且能够提高酶活性。固定化酶的优点，包括一定的机械强度、催化反应过程更易于控制、产品收率高、且控制反应可按一定顺序反应等。

当前广泛运用的固定化方法，主要包括物理吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等[10]，其固定化方法见图1。2。

图1。2 常见固定化方法[10]

Figure 1。2 Four methods of immobilization methods [10]

由于游离酶仍然存在着成本高、稳定性差回收率低及容易变性等缺陷，固定化酶其具有的稳定性，能够使得固定化酶重复利用，在合成反应应用广泛应用。因此，在化学合成包括药物合成领域中，固定化酶技术已得到了广泛的应用，并已产生巨大的经济效益[11]。对于固定化酶的大力研究，具有相当重要的科学价值和广阔的应用前景。但是，固定化酶仍具有无法克服的缺点。比如，固定化酶成本很高，投资过大，对于一些小型试验不适用。此外，固定化酶的利用往往要经过酶的分离与纯化过程，此步骤历时较长，损失较大。 

（3）全细胞催化剂 

游离酶具有回收率低、成本高、稳定性差及易变性等缺点，虽然固定化酶弥补了其不足，但随着实验的进行，逐步显现出固定化酶存在着难以回收、酶活损失大等缺陷。因此，急需寻找更加完全的催化方法，如无需分离纯化、减少酶活损失的全细胞催化剂来催化实验。全细胞催化剂是指利用完整的生物有机体（即全细胞、组织甚至个体）作为催化剂进行化学转化，其本质是利用细胞内酶进行催化，该法是介于发酵法和提取酶催化法之间的一种生物催化技术。来.自^优+尔-论,文:网www.youerw.com +QQ752018766-

细胞内完整的多酶体系可以实现级联反应，弥补了酶法催化中级联催化过程不易实现的弊端，提高了催化效率。同时，又省去了繁琐的酶纯化过程，制备更加简单，生产成本更低。同时，生命科学的飞速发展也大大增加了全细胞催化的可行性，如利用DNA重组技术可使目标酶在不同宿主细胞中大量表达。

综上所述，因固定化酶和游离酶均有难以回收、低的重复利用率等缺点，本文拟制备表达鼠李糖苷酶的全细胞催化剂。

1。2 鼠李糖苷酶

鼠李糖苷酶来源广泛，且易于纯化。真菌中的α-L-鼠李糖苷酶最初是从青霉菌和曲霉菌代谢生产的酶制剂中纯化而来，其中Jaap Visser等使用阴离子交换色谱法分离提纯来源于黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶[12]，Sarita Yadav等使用超滤、阳离子交换柱层析法分离提纯来源于青霉菌的α-L-鼠李糖苷酶[13]。α-L-鼠李糖苷酶是植物细胞壁果胶多糖、糖蛋白以及二级代谢物，如花青苷、类黄酮和三萜烯类等化合物的一种组分，也常存在于细菌杂多糖、鼠李糖脂和细菌外膜脂多糖抗原结构的重复单位中。现有的α-L-鼠李糖苷酶大部分属于水解酶GH78家族[14]，根据文献报道，这个家族的水解酶包含470个蛋白质，其中有13个蛋白质来源于古生菌，394个蛋白质来源于细菌，59个蛋白质来源于真核生物。这些蛋白质中有18个是同类型的。而来源于Sphingomonas paucimobilis的α-L-鼠李糖苷酶则属于水解酶GH106家族，其中包含86个细菌蛋白。水解酶中只有GH78和GH106家族构成了α-L-鼠李糖苷酶酶活的专一性[15]，因此，高专一性的鼠李糖苷酶要从GH78和GH106两大家族中分离纯化。